引言

随着免疫障碍疾病的增长，诺卡菌感染越来越多，感染通常由创伤或肺部吸入引起；脑部是最常见的继发性感染器官，对生命造成严重威胁，所以快速诊断非常重要。可是诺卡菌生长速度慢，标本杂菌多和分离时间长，给实验室诊断带来不少挑战和难题。在质谱检测年代，诺卡菌质谱鉴定便捷快速；但盲目依赖质谱鉴定，养成惰性，把基本的生化形态学知识全部忘掉。人脑不能被机器牵着鼻子走，为了防止鉴定错误，生化形态学不能被抛弃；例如光滑金黄色的菌落可以佐证不达标的皮疽诺卡质谱报告，增加报告的可信度。质谱鉴定本身也存在一定的缺陷，如质谱仪普及率不高，过程交叉污染，坏机维修，质谱鉴定无峰值和鉴定分数不达标等等。

针对以上挑战，我们三人团队经过多年的努力，参考西方先进国家和祖国真菌学老教授的资料，提出和改良以下方法: 一. 快速微观气生菌丝诊断；二. 自来水选择平板；三. 诺卡菌药敏分类鉴定。我们同时介绍近似菌类的辨別和标准药敏方法的最新数据。为了论证以上方法的可行性，王丽老师温故而知新，比较新旧方法；通过接种不同的诺卡菌，在以下三方面做了大量诺卡菌工作: 一. 微观气生菌丝的时效性，十六小时可否看到；二. 诺卡菌加唾液验证自来水选择平板的分离率；三. 以诺卡菌的药敏特性作初步分类的准确性。

虽然诺卡菌生长缓慢，肉眼见到菌落需要至少三天以上，但典型的微观菌落只要十六小时候就出现了

诺卡菌具有两个显著特征：在病人标本直接涂片上，它展示独特的弱抗酸染色阳性(图一)的多向分枝丝状物，同时在透明的自来水平板上产生典型的微观气生菌丝。将临床标本或疑似菌种接种在透明的自来水或者MHA平板上，37℃需氧环境下孵育十六小时，然后把倒置的平板放在显微镜平台上(图二)；通过×10倍目镜检查，诺卡菌展现非常纤细，多向分支的基部菌丝。利用物镜上下聚焦，气生菌丝呈现为深黑色的粗大线条(图三)。在十六小时内，大多数诺卡菌的微观气生菌丝很容易被发现，因此只要提供简易的直接观察气生菌丝的专业培训，配合标本直接涂片上独特的形态，诺卡菌的过夜初步诊断是绝对可能的。

质谱鉴定年代，诺卡菌实验室诊断遇到最大的难题不是分类鉴定，而是分离培养。在诺卡菌最常见的痰标本中，杂菌丛生但诺卡菌生长相对缓慢(图四)，导致假阴性培養报告常常发生。诺卡菌直接镜检虽然特异性高，但高效选择性的培养平板，对分离问题的解决更有作用，因此平板的研发从未停止。我们团队参考1988年美国专家的真菌教科书(参考一)，用自来水平板观察诺卡菌的微观气生菌丝和参考王端礼老教授提出的诺卡石蜡钓饵法(参考二)，两者分别用低营养的琼脂粉或石腊作为生长营养物质，证明诺卡菌生长所需要的营养要求非常低。

王丽老师尝试用自来水平板 (1.3克琼脂粉加入100毫升自来水，121℃高压蒸汽灭菌15分钟) 分离培养痰标本中诺卡菌，发现效果良好(图五)。为了论证自来水平板的选择性，我们参考1990年的外国文献(参考三)用不同诺卡菌制作模拟标本。方法如下: 1毫升正常人唾液加入50微升0.5麦氏浊度的诺卡菌悬液，10微升接种自来水平板和对比血平板进行培养。除了酵母菌之外，大多数杂菌包括大肠杆菌不能在自来水选择平板生长。自来水平板选择性高，方法简单，价格低廉和普及容易。虽然诺卡菌生长缓慢，肉眼见到菌落需要至少三天以上，但典型的微观菌落只要十六小时候就出现了。因此过夜观察微观菌落，可以提早显示诺卡菌的存在。对于一些临床症状典型或者涂片看到杆菌的患者标本，我们团队高度建议加种自来水选择平板，提高诺卡菌的阳性检测率。

常见类似菌种中，诺卡菌最典型最重要的特征是什么？

豕村菌与马红球菌

两者弱抗酸染色均为阳性，马红球菌微观菌落平滑边缘完整，沒有基部菌丝，不易错报。在沒有质谱年代，豕村菌错误报告为诺卡经常发生，其实豕村菌没有微观气生菌丝，并且菌落非常典型独特（图六），只要小心留意，误报是可以避免的。

酵母菌与链霉菌

两者微观菌落都有基部菌丝，骤眼看来外观形态与诺卡菌非常相似，同时链霉菌也有微观气生菌丝和泥土气味，但它们弱抗酸染色皆为阴性，並且酵母菌如毛孢子菌(图七)菌丝相对粗大。

偶然分枝杆菌

基部菌丝形态类似诺卡菌属，但是弱抗酸和抗酸染色两者都是阳性。因此诊断诺卡菌弱抗酸，需要同时进行两种染色。分枝杆菌弱抗酸也是阳性，这个知识点大家要谨慎留意，防止误报。

总而言之，常见类似菌种中，只有诺卡菌在病人标本直接涂片上，显示弱抗酸染色阳性的多向分枝丝状物；它是诺卡菌最典型最重要的特征。

药敏分类最大的优点是验证质谱的准确性

1988年外国专家(参考四)首次提出诺卡菌药敏分类，在没有质谱仪的年代，该药敏分类为实验室提供了宝贵的初步诺卡菌分类信息。2019年法国专家(参考五)对超过500株诺卡菌进行纸片扩散法药敏分类研究，我们的团队参考相关文献，选择五个代表性抗生素，对現有诺卡菌进行药敏分类试验。我们涂抹0.5麦氏浊度菌悬液于MHA平板，加上抗生素紙片，需氧环境孵育37℃，72小时后进行抑菌圈判读。抑菌圈的药敏折点标准参考网站(参考六)连接。我们同时制造了图表以供参考。

图表绿色部分的皮疽诺卡菌，专家共用了149株进行测试，发现97.3%菌株其紅霉素抑菌圈小于22毫米药敏敏感标准。我们一共测试两株皮疽诺卡菌NF#9和NF，它们的抑菌圈分別是6.0和 8.0 毫米。抑菌圈数据与法国专家数据吻合，其他诺卡菌测试与专家数据也基本一致。药敏分类最大的优点是验证质谱的准确性，对于没有质谱仪的医院，药敏分类方法帮助提高诺卡菌鉴定分类水平。当然纸片扩散法药敏分类仅作为鉴定参考，它不能当作正式药物敏感测试。

药敏方法的最新参考标准是什么？

纸片扩散法和梯度扩散法 (Etest) 临床治疗数据欠缺，只可作为初步临床用药参考。金标准方法是美国CLSI批准的肉汤微量稀释法，最新参考标准是M24-A3(参考七) 和M62 (参考八)，我们节录图表和治疗药物以供参考对比。

总结：所以快速精准的实验室诊断，将为临床病情控制提供极大的帮助

诺卡菌感染可能会上行导致严重的脑脓肿，所以快速精准的实验室诊断，将为临床病情控制提供极大的帮助。对此，我们团队提出两个创新快速的实验室诊断方法: 微观气生菌丝探查和自来水选择平板培养法。纵观全文，我们团队从温故知新、引经据典以及实用资讯三个不同方面，阐述探讨诺卡菌感染的实验室诊断及临床药敏治疗。恳请各位老师，提出宝贵意见，改善方法，促进知识交流。

参考文献 

[1] Land, G. A., and J. Staneck. 1988.

The aerobic actinomycetes, p. 271—302. 

Diagnostic manual for mycotic and parasitic infections, 

7th ed. American Public Health Association, Washington, D.C.

[2] Gordon, R. E., and W. A. Hagan. 1936. 

A study of some acid-fast actinomycetes from soil with special reference to pathogenicity for animals. J. Infect. Dis. 

[3] R M Shawar, D G Moore, M T LaRocco. 1990.

Cultivation of Nocardia spp. on chemically defined media for selective recovery of isolates from clinical specimens. JCM.

[4] Wallace RJ, Steele LC, Sumter G, Smith JM. 1988.

Antimicrobial susceptibility patterns of Nocardia asteroides.  

Antimicrob Agents Chemother. 

[5] Lebeaux D, Bergeron E, Berthet J, Djadi-Prat J, Mouniée D, 

Boiron P, Lortholary O, Rodriguez-Nava V. 2019. 

Antibiotic susceptibility testing and species identification of Nocardia isolates: a retrospective analysis of data from a French expert laboratory, 2010-2015. Clin Microbiol Infect.

[6] https:// www.resapath.anses.fr/resapath_uploadfiles/files/Documents/2013_CASFM.pdf (tableau lll, page 9)

[7] Susceptibility testing of Mycobacteria, Nocardiae and other aerobic Actinomycetes. 2018.

Approved standard CLSI document M24 A3. Wayne, PA.

[8] Performance Standards for Susceptibility testing of Mycobacteria, Nocardiae and other aerobic Actinomycetes. 2018. CLSI supplemet M62 1st ed. Wayne, PA.

作者｜王丽、徐汉杰、颜鸿仪 - 香港大学深圳医院；审核｜鲁炳怀、宁永忠

本文完

排版：Jerry