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有关新冠病毒病原学存在的许多未解问题，目前还无法给出一个100分的答案。今天主要和大家交流新冠病毒从病原学的角度进行了哪些研究，这些研究给临床带来哪些提示，特别提到的是在病毒检测方面如何选择方法。从2005年开始，国内团队开展了系统的呼吸道病毒病原学研究，积累了核酸、抗体等检测方法和经验，在新冠病毒检测中这些技术能够在病原鉴定和病原学研究中充分发挥作用。
一、它是谁？
病原学的问题可总结为「六大问题」。第一个问题，它是谁？当发现一个不明原因肺炎或者其他的不明原因感染，它到底是由什么病原引发？
把发现过程整理成文章是重要的「复现」过程，实际上是展示完整的链条——如何确定新冠病毒就是疫情的病原体。这四篇文章中除了有一篇在早期发表，其他三篇文章都是按照要求在1月20日之后发表在各个杂志。当时国内有几个团队按照任务要求同时开展鉴定工作，很快就都锁定了一种新型冠病毒为此次疫情病原。知道它是谁，那么病毒通过何种方式感染细胞？感染哪些组织细胞？病毒传播过程中如何变化？人感染之后的症状是什么样？如何防治？我们针对上述几个问题逐一探讨。
二、新型冠状病毒的发现
十余年前，当我们遇到不明原因肺炎等疾病时，鉴定病原常是猜测排除法。近些年，分子检测技术不断发展，未知病原鉴定技术体系随之不断完善，如此次鉴定新冠病毒鉴定的团队均采用不同的深度测序技术快速获得病毒的基因组序列，结合病毒学经典的技术方法，即病毒的分离培养、病毒抗体和抗原等免疫学特征等来确定新冠病毒是感染病原体。体现在新冠病毒鉴定的文献里，能看到基因组序列特征、分离的病毒引起的细胞病变效应、病毒在电镜下的形态学特征，人体特异性抗体的产生等结果为鉴定依据。其中感染病例血清抗体特征以外周血抗体4倍增高为依据来判定是否有病毒感染等。这些方法都是病毒病原学研究常用的检测方法，在所有检测鉴定方法中分子检测仍是较快速的，可以帮助我们快速病毒筛查；病毒分离培养等病毒学上的「金标准」检测方法耗时长。
新冠病毒发现以后，从感染症状上来看，部分病人会出现严重急性呼吸综合征（SARS），据此命名为SARS-CoV-2。根据基因组序列特征，新冠病毒的组成与SARS等冠状病毒家族成员比较接近，从5'端开始前2/3的区域都是编码病毒聚合酶的基因，后1/3是编码包括刺突蛋白（Spike, S）、包膜蛋白（Envelope, E）、膜蛋白（Membrane, M）和核衣壳蛋白（Nucleocapsid, N）等病毒主要结构蛋白，在这些结构蛋白中穿插着小的开放读码框编码非结构蛋白，这些非结构蛋白是拮抗宿主天然免疫反应，诱导宿主焦亡或者凋亡的重要蛋白分子。
验证满足Koch法则
从发现新冠病毒以后，我们会看到很多通过自媒体或官方媒体等渠道发布的信息，如「某地方测了一条序列，已经证实为××」，这是非常不严谨的说法。要证实一个新发疾病病原，不是有点序列就可以判断，即使从基因组特征确认了新型冠状病毒基因序列的存在，判定其为感染病原但仍需遵循科赫法则。
对于新冠病毒来讲，我们团队与中国医学科学院医学实验动物研究所的老师合作，很快就把这一条链条形成一个闭环的证据全部拿到。从基因组与生物信息学的角度来看，我们知道这是冠状病毒序列，在细胞上分离出来新冠病毒，也可以明确其冠状病毒的形态，那它到底是不是致病病原呢？
这组实验，是在前面已经确定病毒基因组特征、分离到病毒的情况下，用病毒分离株感染转人类ACE2基因小鼠（hACE2小鼠），能够看到实验小鼠体重下降，肺部炎症的表现，病毒S蛋白和hACE2受体被发现共定位于肺泡上皮细胞，最关键的是从小鼠的感染组织中分离出新冠病毒，经过基因组测序与感染的毒株序列基本一致。这个过程在文章中是很简单的一张图片，但拿到一张满意的图片难度还是比较大，记得负责电镜检测的老师用了一个通宵拿到这张图片。上述提到的四点就是经典的科赫法则，我们把链条完美地呈现出来，就可以确定它就是导致新冠肺炎的病原。
第七个可感染人冠状病毒
上图为感染人类的冠状病毒的家族谱，图中红字都是可感染人冠状病毒。从1966年人冠状病毒229E和1967年人冠状病毒OC43发现以来六十余年时间，我们只认识2种可感染人冠状病毒。2003年的SARS-CoV出现，SARS之后的2004年，港大的袁国勇教授以及荷兰的学者发现两个新型可感染人冠状病毒，即HKU1、HCoV-NL63。随后，又过了约8年的时间，在2012年发现了MERS-CoV。在2019年，又出现了SARS-CoV-2。所有的人类冠状病毒都是跨种来源。2003年后由于溯源需要，在蝙蝠等野生动物体内鉴定出多种动物冠状病毒，能否从动物体内早期鉴定出可能感染人类的病毒，这是病原学研究中重点关注的内容。积累的冠状病毒基因组特征等数据也为后续寻找病毒演化特征提供了必备的基础参考数据。
新型冠状病毒形态
表面是冠状的皇冠样的结构。
在细胞里面会形成大量的囊泡样的状态。其实很多冠状病毒都会形成这样的囊泡样结构，这种囊泡的结构与病毒的致病机制密切相关。但是这方面的研究起步比较晚，现在还没有太大的进展。
病毒结构与功能
从公开发表的文章时间轴上可以看到，首先我们要清楚新冠病毒如何感染人类，找到受体是我们做病原学研究中首要完成的工作。从早期发表的病原发现的文章中，对基因组特征的描述上，可从基因组成结构特征上预测受体类型，预测到新冠病毒可能会利用ACE2感染人类。很快国内的几个团队背靠背解析出这个结构，明确新冠病毒的受体就是ACE2，同时也都知道了TMPRSS2（跨膜丝氨酸蛋白酶）所起的作用。那么，新冠病毒是否存在其他的人体受体？
新冠病毒引起的肠道反应是既往在人感染冠状病毒中一直存在的，比如感染新冠病毒后引起的腹泻等。基于肠道类器官开展新冠病毒感染的研究，发现CD147可能是新冠病毒的受体，细胞实验发现阻断CD147可抑制病毒在肠道细胞和肺、肝脏、皮肤等来源的细胞上的复制。
新冠病毒感染细胞系
病毒感染不同组织来源的培养细胞系，如果能形成有效的感染，提示其可能在人体感染过程中攻击相应的组织器官。这是做病毒病原学研究的关注点之一，体外细胞培养结果与人体组织细胞的嗜性并不是完全的一对一的关系，但至少会给我们一个提示可能的器官嗜性。
新冠病毒可以在肺腺癌Calu3细胞、肠腺癌的Caco2细胞、肝细胞癌的Huh7细胞上复制，还可以在肾脏细胞、神经系统来源的细胞上复制。这些容许新冠病毒复制的细胞，高度提示其在人体感染过程中的器官嗜性，对于理解病毒致病机制有重要提示作用。
组学技术手段的应用也进一步加速了对新冠病毒感染特征的认识，如大规模的单细胞测序、转录组测序、蛋白质组学筛选等方法，使我们能够在第一时间获得更全面数据来帮助我们去重新认识新冠病毒对人体感染的特点。这篇文章对36个组织进行转录组分析，分析哪些组织同时表达ACE2和TMPRSS2。表达丰度从高到低排序，肺部的AT2细胞、巨噬细胞等表达量较高。
此外，在全身的各个组织脏器上也都分布有这两种病毒复制相关的关键宿主因子，如心肌细胞、肾上腺和睾丸的基质细胞等。大数据线索还有哪些提示呢？病毒使用的受体也是人体生理活动下必需的宿主因子，受体高表达区域可能对病毒嗜性器官具有提示作用，但需要注意细胞类型和组织分布部位，是否自然感染状态下病毒能够直接接触到这些细胞。此外，要考虑是否有病毒血症，病毒可通过二次体内分布攻击各个器官。COVID-19病人临床表现具有心脏受损、肾脏受损等多器官功能损伤，重症病人血液中可检测到病毒核酸，提示存在病毒血症，而上述容易出现功能受损器官的组织细胞上有ACE2等受体的表达，提示病毒可能通过血液、体液等导致全身多脏器的直接损伤。
对ACE2等受体分布特征的研究也外展到宠物、野生动物、家禽等不同物种，对病毒受体表达特征的研究，发现猫的AT2细胞、成纤维细胞、杯状细胞等都有受体高表达，宠物猫在病毒传播中的作用还需要深入研究，仅仅通过受体分布特征的数据还不能提供更多的证据。除了表达水平，后续要关注不同物种ACE2受体结构上的差异。
有研究提出44种哺乳类动物的ACE2可介导新冠病毒进入靶细胞，还发现了不同种类的猴子的反应都不太一样，如新世界猴ACE2不支持病毒进入细胞。这些数据提示高表达病毒受体的物种在病毒自然传播中的潜在作用。进一步仍要深入对ACE2关键功能位点的解析，更有助于我们认识新冠病毒的跨物种感染。
三、怎么检？——检测方法
新冠病毒对人群是普遍易感的，怎么能更快找到感染的病人，也就是要采用什么检测方法？现有的检测技术包括检测病毒颗粒，检测病毒蛋白和遗传物质（核酸）以及检测病毒感染之后人体的反应。随着方法学上的不断改进，我们能够更快、更灵敏和特异的检测方法。
检测病毒有哪些常用的方法？
第一，病毒的分离，是病毒检测的金标准。用动物、培养的组织细胞培养、鸡胚等接种样本进行病毒的分离。但是病毒的分离是高技术依赖性，依赖于样本质量、病毒嗜细胞性以及分离体系，因此病毒分离是领域内重点发展的一个方向。新冠病毒可采用3D培养细胞系、非洲绿猴肾细胞（Vero和Vero E6）分离培养。
第二，血清学方法，包括中和试验、补体结合试验、红细胞凝集/抑制试验等，检测病毒蛋白和宿主感染后的病毒特异性抗体；现代发展的免疫学分析方法，包括酶联免疫和免疫荧光方法等，检测病毒抗原、IgM和IgG抗体等是对经典血清学方法的补充。这些方法具有较强特异性，但敏感性不足。其中，中和试验是判断病人是否产生能够中和病毒的抗体，需要使用活病毒，在生物安全III级实验室操作。
第三，分子生物学技术，新冠疫情让大家熟知的聚合酶链反应（PCR技术）就是常用的核酸分子生物学技术，此次病毒鉴定使用的高通量测序方法也是当前病原学检测上应用的技术。
第四，电镜技术，用于病毒形态学鉴定和观察，高技术依赖性，需要电镜设备。
这些检测方法各有优缺点，在方法学的使用上要根据实际情况选择。虽然我们做了很多年的病毒病原学研究，做了大量的核酸检测，但是做呼吸道病毒的核酸检测，既往在三甲级医院等医疗机构并没有实现常规检测。在当前常需要进行核酸大规模检测情况下，应高度关注核酸气溶胶污染，这对于实验室空间要求和个人技术能力等的要求很高。发展通量自动化核酸提取和检测平台，推进非核酸提取方法的封闭式的快速检测平台都是核酸检测方面亟待发展的内容。希望这次的新冠疫情能够作为一种助力，推动快速检测技术的发展。
监测病毒基因组的突变
病毒核酸检测要求检测引物（探针）序列与病毒基因组序列的匹配，新冠病毒的基因组为RNA，在自然演化和在群体免疫压力下是不断发生适应性突变。在国家基因组科学数据中心和国际多个数据网站上都可实时更新基因组突变情况。监测突变可以帮助我们去发现检测核酸的引物靶向基因区域是否发生突变，会不会容易产生脱靶的现象。毒株序列在其流行早期被分为S和L型，2020年1月7日前后，在武汉和非武汉地区S型别的分布呈现显著差异；经过全球近半年的流行适应，核蛋白基因R203K和G204R的突变株在全球多地出现；刺突蛋白基因D614G的突变株逐渐成为主要流行毒株，这一毒株被认为具有更快的传播能力。因此，对突变的监测不仅对检测方法的优化有重要作用，更是发现新的传播特性毒株、评估病毒流行特征的关键。
对突变的监测也可以从人体内突变分析角度来进行。群体中出现的突变病毒基因组，是病毒在个体内复制和群体间传播选择过程中逐渐形成的优势毒株。病毒人体中每复制一次，会产生0.01~0.0001个位点出现突变，这种突变与病毒聚合酶纠错功能不足和个体免疫压力的选择有关。因此，每个病人体内带有具有不同突变位点的基因组序列，称之为病毒准种。个体内不断选择形成的最有复制和传播优势的毒株逐渐形成了群体优势毒株。因此，对新冠病毒的宿主体内的突变监测，可有助于对群体流行株突变演化提供参考数据。
基于体液免疫反应特点建立检测体系
抗原交叉反应分析
核酸检测并不是完美的，受到了很多因素的制约，如样本采集的质量、储存运输温度和检测灵敏度等，还受到不同感染病程的影响。基于此，我们团队较早提出联合应用IgM抗体检测提高感染病例的检出氯。建立抗体检测方法需要要先找到特异性的抗原，这个抗原不能与其他病毒抗体有交叉反应，否则就不知道检测出来的抗体是A病原引起，还是B病原引起。经过分析，发现新冠病毒只和SARS的N蛋白有反应，但是当年在SARS期间只感染了8000多人，而且他们不可能是IgM阳性了。所以当时我们用N蛋白去检测IgM的抗体。随后方法学上的不断积累发现联合N和S蛋白能够进一步提高灵敏度。因此，对于核酸检测阴性的病例，联合检IgM抗体分析，有助于发现早期感染病例。
SARS-CoV-2感染患者抗体特征
血清IgM、IgG抗体检出率与PCR阳性率
从抗体的流行特征上来看，如图所示，黑线是PCR检出的阳性率，红线是IgM的检出率，绿线是IgG的检出率。症状出现后1~3天时，PCR阳性率为>90%，6天时下降到80%以下，14天时下降到50%以下；前5.5天，PCR法的阳性检出率高于IgM ELISA法，而在症状出现5.5 d后，IgM ELISA法的阳性检出率高于PCR法。
抗体检测辅助COVID-19诊断
左图显示的是在PCR检测阳性的患者中，IgM阳性的患者占75.61%，阴性占24.39%；在PCR检测阴性的患者中，IgM检出率达到了93.1%。同时对病人开展PCR和IgM ELISA检测，阳性率可以达到98.6%。这是针对武汉最早期的那一批病人的数据，我们在针对不同的感染时期，病人的特点和人群的特点，这种方法对提升检出的比率要重新评估。
四、为何不同人感染后症状不一——致病性
疾病表型多样
我们已知人冠状病毒的感染特点是轻症或无症状，主要引起呼吸道感染、干咳等，也有胃肠道症状等，偶可导致重症呼吸道感染等。但新冠病毒引起的COVID-19疾病表型多样，会引起多系统受累，结膜炎、皮疹、水肿等症状，在儿童还可导致川崎病。因此，新冠病毒对于我们而言的确很「新」，作为临床医生还是要很细心地观察病人，尤其对于新冠病毒核酸检测阳性的病人，把他的症状、体征做好记录，这对我们更深刻地认识新冠肺炎非常有帮助。对于我们做基础研究或者做病原学研究的人来讲，很期待能看到临床方面系统的疾病类型总结。
为什么不同人群感染新冠病毒的症状不同，这是个比较难回答的问题。一般来说，感染后症状的轻重要从病毒和宿主这两个角度考虑。在早期，病毒突变没有那么强，病人感染的毒株几乎都是同一个来源的毒株时，更多的要从宿主的角度来考虑。上图是我们利用病毒感染的病人的BALF做的转录组，相比SARS-CoV，SAR-CoV-2诱发了更为显著的IFN反应，在COVID-19病人BALF中，检测到大量干扰素诱导基因的表达。病毒感染人体产生的大量炎症因子，引起的免疫病理反应被认为是组织器官损伤的重要机制。
病毒感染细胞后的免疫反应
免疫病理损伤与炎症过度激活有关。目前认为病毒感染表达ACE2/TMPRSS2的细胞，使宿主细胞发生裂解并释放损伤相关的分子模式（ATP，核酸，ASC低聚物），被邻近的上皮细胞、内皮细胞和肺泡巨噬细胞识别，触发促炎性细胞因子和趋化因子的产生（IL-6，IP-10，MIP1α，MIP1β，MCP1），将单核细胞、巨噬细胞和T细胞吸引到感染部位。在临床上会使用细胞因子检测试剂盒，在血中或者在呼吸道样本体液中检测出的细胞因子就是这样的方式产生的。部分细胞因子的改变与疾病的严重程度呈现关联性，借此可提出相应的治疗策略，如用白介素6拮抗剂来限制炎症损伤等。对病毒诱发炎症因子、其调控宿主信号通路关键因子的识别，有助于为抗病毒感染提供更多的靶点。
宿主易感性
遗传易感性被认为与COVID-19严重程度有关。研究较多的包括干扰素诱导穿膜蛋白3（Interferon-induced transmembrane protein-3（IFITM3）和TMPRSS2等。
IFITM3与COVID-19严重程度关联
一项基于80个病人的研究发现IFITM3的RS12252位点发生CC的纯合的变化在重症和死亡病例中的比例更高。另一项研究发现，IFITM2和IFITM3转染细胞后能够很好地抑制新冠病毒的复制。这些研究从宿主角度给出疾病重症关联的影响因素。
TMPRSS2 突变与 COVID-19 严重程度的关联
这项针对TMPRSS2的突变体开展的研究，在意大利人群中发现TMPRSS2的突变体与疾病的严重程度有关。虽然这些数据的人群数比较小，但还是能够给我们提示遗传易感性到底在急性病毒性感染中起什么作用。急性重症呼吸道感染的遗传易感性一直是领域内难以回答的问题，主要原因是病例入组难度大。在新冠疫情中，全球科学家针对易感性的问题在不同地域开展的同质化研究，有助于在更多的病例数量基础上揭示宿主基因突变与病毒感染及疾病严重程度的关联。
近期，英国将要开展一项约2万个病例的遗传易感性研究，国内的一些小规模的数据可能即将公布，数据的积累有助于推进未来个体化医疗。
病毒感染的不同阶段，如何把研究中发布的数据与临床的症状和体征结合起来，在防治的角度寻找一个切入点，这一点是单纯依靠研究人员是无法完成的，需要大家的合作与交流。
五、到哪去？——演化突变
基因片段缺失和点突变
前文我们提到监测基因组突变在优化检测方法中的作用，也提及新的突变形成的主要流行株传播力的改变。对突变特征和突变后毒株传播致病等特点的认识，也就是对其演化方向和特征的了解对于疫情防控非常关键。病毒基因突变包括基因片段的缺失和点突变。当前病毒基因组数据比对可以看到 ORF 8区域 382nt缺失和美国出现的ORF7a 81nt缺失。这种缺失突变株导致病毒毒力减弱。
现在大家最关注的突变热点就是S基因的D614G突变，突变病毒株在全球已经成为主要流行毒株。目前在细胞学水平的研究可见D614G突变能毒株病毒表面的S蛋白增多，同时病毒稳定性增强，它感染人源细胞的能力增强。614G位点突变在群体中的传播力是不是也会更强，需要流行病学的数据来帮助佐证。对于病毒的演化来说，我们即使不知道它的来源，但至少密切关注它的突变对人类的影响有多大。
防和治
药物、疫苗、治疗性抗体等防治方法的研究和建立从新冠疫情开始即在全球多个基础和临床的研究组展开。对FDA批准药库的筛选，找老药；从转录组、蛋白质组不同层面揭示病毒和宿主细胞蛋白因子相互作用图谱的绘制，筛选新的药物作用蛋白靶点，这些工作为抗新冠病毒有效安全药物的发下提供了大量可参考的数据。
在过去的半年中，一些中药、克立芝、瑞德西韦等临床实验陆续开展，虽然没有达到大家预期的完美结果，但积累的经验为我们后续研究工作提供很好的基础依据和提示。
六、从哪里来——起源
跨种病毒的溯源问题很难回答。对SARS冠状病毒的溯源我们用了十几年的时间，有很多团队非常努力工作，一点一点去寻找线索。对于MERS来讲，因为有SARS的相关经验，尤其是MERS的流行比较局限于中东地区，所以推断起来相对来说比较容易。
但是对于新冠病毒，虽然基因组证据提示新冠病毒可能来自于蝙蝠，但是否有中间宿主，是哪种动物仍然不明确。部分人就认为穿山甲可能扮演了中间宿主角色，但是依据仍不充分。因此，对于新冠病毒起源的确定还需要有大量的工作。
是否存在中间宿主？突破种属屏障的分子机制？
新冠病毒如何突破种属屏障机制不清。已知人类的冠状病毒中间宿主可能经历了羊驼、猪和骆驼等，而新冠病毒的中间宿主尚不十分明确。对宿主适应性的研究，是基于禽流感病毒的研究进展较快，以下以禽流感病毒为例说明。
宿主的适应：以流感病毒为例
病原从野生动物到中间宿主到人身上适应的过复杂。以流感病毒为例，我们身体里面的宿主因子ANP32A决定禽流感在人类的适应性，正常情况下，禽类的病毒在人体细胞上不太容易复制，这就是宿主的天然屏障。但是病毒就是一个点的突变，就会突破宿主屏障。对于宿主适应性的演变，也有可能帮助我们去找到它的源头，比如聚合酶活性的调适、受体的适应、宿主限制因子的突破等。
近十余年来，引起重大公共卫生事件的新发突发病毒多来源是野生动物，未来我们遇到这种跨种来源病原影响的风险会持续存在。因此，不论是做疾病防控，还是临床工作；不论是医生，还是研究人员，始终要绷着一根弦，那就是考虑接触到的不明原因感染事件是否为新发病原引起。新冠病毒是近百年来人类面临的相当于一次灾难性事件，是否会有同类病原跨种仍是未知。对于现场的临床医生，在门诊上看到了一个不明原因发热的病人，明确感染病原实现精准治疗对于早期发现新发病原是非常关键的。用合适的方法鉴定出病原，用更可靠的手段去明确它的传播力，把信息迅速和大家共享，合作共享有助于能够找到更好的防治方法。这一点是我今天特别想传递给大家的一个信息。
新冠病毒资源共享
> 2019 Novel Coronavirus Resource (2019nCoVR). Data, tools, literature
https://bigd.big.ac.cn/ncov/?lang=en
> SARS-CoV-2 Genome Sequencing Data DNA Sequencing：Data https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/sars-cov-2-seqs/
> SARS-CoV-2 Transcriptomic Map RNA Sequencing Data：Open Science Framework: accession
number doi:10.17605/OSF.IO/8F6N9
> SARS-CoV-2 and Human Protein Interactions Mass Spectrometry Raw Data：http://proteomecentral.proteomexchange.org/cgi/GetDataset?ID=PXD018117
> SARS-CoV-2 Strains Genomic Epidemiology：
https://nextstrain.org/ncov， https://www.gisaid.org/， https://bigd.big.ac.cn/ncov
> The COVID-19 Host Genetics Initiative Host Genetics Data(GWAS, WES, WGS https://www.covid19hg.org/
> COVID-19 Cell Atlas Single cell transcriptomics data www.covid19cellatlas.org
> List of Clinical Trials Clinical Trial Related Information， https://clinicaltrials.gov/ct2/home
上述网站是和大家分享的新冠病毒资源，这些数据全球的疫情防控能够提供一些参考，给临床的防治提供一些线索是至关重要的。
是否会有新的冠状病毒侵入人群？
疫情当前，似乎提及未来可能新的冠状病毒的出现有些早，但是新冠疫情带来的巨大影响，提醒我们如何建立早期预警机制。病毒的跨种是一个很复杂的过程，前面我们提及冠状病毒是从动物跨物种到人体上，进行病毒病原学研究的人员会加大动物源、临床不明原因感染等疾病的病原组发现研究。临床医生是一线直接面对病人，接诊病人的时候，面对一个发热或者呼吸道感染的病人，做好个人面不防护做好自我保护，避免成为院内传播源；针对无法明确病原的病例，选择合适的实验室检测方法，快速鉴定可能的感染病原，临床的需求也能推动检测技术的完善和发展，更好地帮助临床解决病原鉴定难题。
答疑讨论
王一民：您刚才提到，一定要找到合适的标本去做明确的检测，这样得到的结果才更加可靠，这应该是未来应用到临床中比较好的办法。我们在临床也在思考，到底什么人该用什么样的方法去发现不同的病原体，这一直是很困扰临床的问题。比如血流感染，用血培养的方法很好，可能用核酸检测未必比血培养更加敏感；现在有很多结核的分子检测，普通的抗酸染色比结核的培养敏感。但对于病毒而言，到底用什么标本、用哪种检测，还是非常困扰的一件事情。要解决这个问题，您认为临床和实验室需要做哪些沟通？临床可以提供不同类型的标本，实验室可以有不同的检测技术，怎么完善临床与实验室之间的关系，去开展合作或者研究？
任丽丽：这是非常关键的一个问题，没有好的样本就相当于「巧妇难为无米之炊」，对于实验室来讲，有多好的办法也做不出来。但是如何拿到好样本，并不是一成不变的。对于呼吸道感染来说，检测人员很喜欢去问有没有深部的样本，比如如果是肺炎，我们就想要找到深部的样本。但是新冠肺炎的事情告诉我们，并不是所有的医疗操作都很友好，那我们就不找侵袭性的样本，但至少要拿到深部的痰样本，没有痰的话可以诱导痰。采拭子也可以，王辰院士一直强调采集鼻咽部拭子，因为鼻咽部的血流非常丰富，我们曾经做过比较，鼻咽部检出率比较高。所以，当你怀疑是呼吸道病毒感染的样本时，即使它可以引起其他类型的疾病，比如手足口病可以是呼吸道病毒感染的，但它引起手足口症状，在早期去找到呼吸道样本也能够检测出来。
所以，不论在科研还是与临床医生相互帮忙做相关工作的时候，我们首先强调的一点就是一定要找症状部位的样本，非常关键。因为我们曾经收到一份血样本，请我们查一下是不是有流感病毒感染，普通的流感是很少能看到病毒血症的阶段。做呼吸道病毒检测的话，呼吸道样本很关键，如果找不到深部的样本，那采集鼻咽拭子，采样的手法要经过专业的训练。同时，我们建议采集呼吸道样本的时候，尽量去采集一份血液样本，目的不是为了检测病毒的核酸成分，为了后面可以取病人的双份血去看抗体增高的情况，这也是最经典的血清学方法。有人会觉得这个方法不是很聪明，不能够早期快速诊断，这就是方法学的问题，前面给了核酸检测的结果，你可能知道是流感病毒感染或者是副流感病毒感染，但到底是不是这样的结果，血清学方法可以用来佐证。这就不能说太急于求成了，因为呼吸道病毒临床检验方面待完善的地方比较多，实验室的结果真正反馈到临床上，大家之间的思维方式和考虑问题的角度还需要磨合。
王一民：是的，技术上有很多手段，临床有需求又很急迫。临床上往往是特别危重的病人才需要送到特殊的机构去进行检测，这样的情况又着急得到结果。所以也不能说是鸿沟，但是至少目前在沟通上还不能达到完全匹配的状态，可能需要更多的解决办法。作为临床医生来讲，至少要坚持一点，既然要去送检，就要选择更优质的标本。刚才提到的更深部的标本、BALF标本，甚至是肺组织的标本，拿到检验机构检测，这样得到真实准确的结果的可能性也很大。
任丽丽：因为现在有很多可以选择的方法，并不像10年前只能做PCR检测等方法。时代不一样了，有很多第三方机构做得很好，比如深度测序等，都可以完全利用起来。当然，检测结果是需要临床医生根据病人的感染特征综合判断，并不是说检测结果是A，感染病原就是A。
王一民：还有一个问题，原来认为二级医院可能开展病原检测的能力不足，但是这次新冠疫情因为检测人员的数量和标本的数量很大，所以要求二级以上的医疗机构都要加强核酸检测的能力，尤其是病毒检测能力的提高。这种情况下，您有没有什么建议给这样的机构作为规范、精准的要求，提供给二级医院，是不是简单的按照试剂盒的步骤去做就行。
任丽丽：绝对不是这样的。因为从检测角度使用的样本提取的核酸，我们肉眼是看不见的，但是核酸也会有气溶胶，这种核酸气溶胶会污染样本。大家都会看标准操作程序（SOP），都会用试剂盒，按照A+B+C配置体系，放在PCR仪里面，设定程序。但是要注意每次加个模板，用加样枪吸入的时候，动作要轻柔，否则引起的气溶胶可能会污染下一个样本。所以强调在目前没有可用的封闭式设备的前提下，还要通过提取核酸加模板的方式去操作时，一定要做好分区，配液室和加入模板的时候采用物理分割，加取样本的人一定要稳，不求快，核酸气溶胶的污染一旦形成，去除难度较大，对实验结果影响非常大。
还有，定期在实验室做一个阴性对照，每一批都要做阴性对照，现在遇到的阳性病例不是很多，形成气溶胶几率小。但假设会有下一轮疫情来袭，不一定是新冠病毒，也可能是其他病毒，大规模操作阳性的样本，或者操作含有高浓度病毒样本，可能引起的潜在污染的风险还是很大的。所以一定要看好房间的定期的检测污染，一旦发现这个房间有问题，马上要更换房间，所以我们要求为核酸检测提供物理分隔。基层医院可能没有这么多的设备去配备，比如通风负压的房间，但是相对房间会比较重组，多备几个加模板的房间，分期使用，有助于控制核酸气溶胶的污染。
总结一下，这是我自己的经验教训，我做了将近有十几年的PCR检测，应该有上百万个了，指导了很多人。我们会呼吁大家一定要注意这几点，第一，房间的物理分割。第二，建议大家配三套加样枪，现在经费都不是大问题，因为在做PCR的时候，尤其是RT-PCR的长度只有80~120个bp（碱基长度），它是用酶去消化，很难降解，只能通过自然沉降。一般情况下，加样枪用了半个月之后就放在一边，让它自然沉降，换一把新的加样枪，每半个月换一把加样枪，注意在大量加样的时候可能会遇到排枪，如果使用自动设备没有关系，但是使用排枪加的话，第1道和第8道这两个会容易有边缘效应，容易出现异常的污染情况，所以要求检测人员格外关注做实验的时候第1道和第8道有没有假阳性。第三，操作人员要健康，如果有，发烧、身体不适、腹泻和呼吸道症状，不论轻重，不要进入检测区域，可能携带的呼吸道病原，并不能被佩戴的外科口罩有效阻隔，可能会导致检测体系污染。
王一民：您说的这几点很重要。特别是在这段时间面临大量的临床检测样本涌入实验室，大家的精神压力、身体压力都很大，而且各级领导给我们的压力也非常大。所以当面对这样的挑战的时候，如果大家做过一点基础研究的话，可能都接触过PCR技术，一定要沉下心来，踏踏实实的去做，从加样的步骤到后面所有可能会遇到污染的环节都在脑海中想清楚，这对解决临床的问题和拿到真实的结果至关重要。
刚才您也提到，现在有自动化的仪器，比如小型的、快速的核酸检测试剂盒，目前有没有国内应用的或者比较成熟的试剂盒吗？还是在努力的研发过程中？
任丽丽：对于新冠病毒来说，一些国内的科学家们正在努力研发，已经有一些雏形出来了，也得到了科技部的支持，也期待这些设备能够尽快研发出来。我对这次的新冠疫情的感触很深，很多年轻一代的优秀科学家原来是做比较高端的方法学，这次也都能够沉下心来，在这半年安安心心的去做一件事情，怎么样能够不需要提取核酸就能够快速的在社区或者在家里把核酸检测做完，所以这是理念上的变化，肯定会推动着更多的、更好的检测方法出来，这方面我们还是很乐观的。
王一民：还想请您再帮我们深入评价一下抗体检测和抗原检测。在流感中使用抗原检测比较多一些，但是对于新冠肺炎来说，好像一直没有听到太多关于抗原检测的信息。抗体检测听到的比较多，但是质疑的声音和讨论的声音也非常多。
任丽丽：新冠病毒的抗原检测和抗体检测是在检测试剂研发和审批过程中大家都非常关注的一点。首先要明确一点，对于病毒感染来说，抗体检测的方法学是没有问题的。第二，为什么大家会有这么多质疑？还是因为对它的特异性、灵敏度存在一些看法，包括我们发表文章之后也受到质疑，认为我们的特异性有问题，后来我们给予了回答。现在我们获得批准的一些抗体，已经很明确说明不能做群体流调，因为可能有很多因素存在，但是对于临床医生来讲，怎么去选择？如果你高度怀疑一个病人是新冠病毒感染，但是怎么做核酸检测都是阴性的，千万不要忘记血清学方法能够忠实地反映病毒在体内感染的情况，所以不要排斥去做抗体检测。但是抗体检测并不是只做出新冠病毒总抗体阳性就好，还是要明确抗体类型是IgM还是IgG。
现在新冠肺炎虽然正在流行中，我们不能叫做后新冠时代，但是可以叫做即将面临的后感染阶段。第一轮感染已经结束了，临床医生如果手上有一个试剂盒是检测新冠抗体的，在明年或者今年冬天，怀疑一个病人是新冠病毒感染，做出来的结果又是阳性的，没有办法判断它是既往抗体残留下来的，还是新感染的，所以一定要进行分型去测IgM。还要强调，这也是我们和各个企业曾经强调的定量的问题，滴度的变化会更好地帮助临床医生去回答这个感染有没有进展的过程，因为这就是大家所说的无症状感染或者长期持续排毒，如果监测血里面的抗体，会帮助我们认识病毒到他的身体里有没有低水平的复制，但是有时候低水平复制的确不能刺激体液免疫，这也符合疾病多样性特征的。总指，不要排斥抗体检测。我们强调的两点，第一点是一定要分型，第二点是要研发定量的试剂盒。
关于抗原检测，目前还没有产品获批使用。但抗原检测对于确定早期感染是非常关键的方法，亟待发展。但是抗原检测体系的特异性、灵敏度、检测时间、窗口期等受到很多因素影响，也需要使用新鲜未灭活样本，要考虑好应用的场景。国内有几家研究机构和企业在努力推进抗原检测试剂。其实用过流感的抗原检测的临床医生都知道，大概50%的检出率，但是即使是50%，也能极大的缓解临床的压力。所以，我尽快尽早推出抗原检测方法。
王一民：对，实际上临床医生或者像我这样的临床医生去看待一个感染相关的疾病，确实是这么追求的。要追求病原诊断，找到敌人是谁，同时要了解敌人对人体的一些损害的表现，就是要检测相应的一些免疫反应，无论是抗体，还是特异性的临床特征，还有拿到最精准的像病理的证据，如果拿不到病理，影像学在很大程度上是间接的病理证据。所以为什么对高危人群要推行所谓1+3的政策，病人的核酸检测+CT+抗体检测＋血常规，这样的检测对于高危人群是非常可靠的临床诊疗思路。最后能不能请您帮我们再总结一下对于新冠肺炎的看法，还有对未来包括核酸检测的一些建议。
任丽丽：对于首当其冲的检测方法来说，目前我国在多个层面上已经帮助去梳理了核酸检测的流程，核酸检测可以作为快速普筛，也是经济的方法，在未来一段时间仍然会在检测的领域中占有主流。同时包括国内的科学家在努力推进，快速发展出来免提取、高灵敏、易判别、短时间时之内就给出检测结果的方法，这是指日可待的，也是核酸检测领域发展的一个方向。但是我们在发展这些检测方法的同时，千万不要忘了去追踪新冠病毒的突变，因为我们不清楚曾经选择的保守区域是不是在新冠病毒上也会一直保守下去。对于检测方法而言，一定要综合评估病人需要什么样的方法，如果从发病到来医院看病是早期的情况，核酸检测肯定首当其冲，如果做了几次是阴性的话，不要排斥做血清学检测。从没有抗原检测试剂可以使用的情况下，现有的可以分IgM、IgG抗体分型的方法还是可用的，帮助我们去辅助早期判断病人的感染情况。
从研究的角度来讲，目前还处于婴儿期，需要不断积累知识，面对新冠病毒我们仍然是一个初学者，我们要用很严肃的态度来对待它，不论是从科研、防控，还是临床诊疗上。
王一民：再次感谢任教授。我在十期直播中也有一些感触，大家通过新冠疫情又一次认识了医生，也新认识了公共卫生领域的技术人员。我相信大家应该也认识到新冠抗疫过程中的科学家和技术人员，他们在幕后发挥了巨大的作用，从发现病原，发现早期突变的检测，发现一些新型的成品化的试剂盒应用到临床，发现未来的趋势，去试图解释溯源的问题。所以，抗疫的英雄一定有这些伟大的科学家在幕后。我期待更多的对于新冠病毒的科学研究的诞生，也希望大家除了关注医生、公卫人员之外，也一定要继续支持和关注在幕后的那些科学家们。
本期直播嘉宾
任丽丽
博士。现任中国医学科学院病原生物学研究所 克里斯托弗·梅里埃实验室副主任、研究员、博士研究生导师，实验室管理处处长。主要从事呼吸道病毒病原学研究。入选教育部2012年新世纪优秀人才培养计划。现任国家卫生健康委病原微生物实验室生物安全评审专家委员会委员，中华预防医学会生物资源管理与利用分会第一届委员会委员、中华预防医学会感染性疾病防控分会第一届委员会委员和中国研究型医院空间微生物与感染专业委员会委员等，中华实验和临床病毒学杂志通讯编委等。
主持人介绍
王一民
中日医院呼吸与危重症医学科主治医师，中国医师协会呼吸分会青年委员会委员，中国医疗保健国际交流促进会临床微生物与感染分会青委副主委。