检验科医生经常引用这样一句话：“每一份标本后面都是一个生命。”这是我开篇最想讲的一句话。近年来，侵袭性曲霉病（Invasive Aspergillosis, IA）逐渐受到广泛关注，今天我与各位分享关于曲霉病分子诊断的最新进展。

全球每年超655万人受到真菌病的威胁，超375万人死亡……真菌感染形势严峻

发表于今年1月的《The Lancet Infectious Diseases》上一篇文章，题为“Global incidence and mortality of severe fungal disease”，揭示了全球范围内严重真菌病的发病率和死亡率。实际上这一现象与近几年来的新冠疫情存在一定的关联性。该报道最新数据显示：全球每年有超过655万人面临真菌病的威胁，其中超过375万人因此病而丧生。在这些与真菌病相关的死亡案例中，大约255万人（占68%）的死亡可直接归因于真菌病。

[1].Denning DW. Lancet Infect Dis. 2024 Jan 12:S1473-3099(23)00692-8.

COPD患者中，IA总发病人数约为1,513,000例，合并IA的总死亡率约为43%-72%，归因死亡率约为83%-90%；ICU患者确诊IA的粗死亡率约为46%-82%，归因死亡率约为51%；肺癌合并IA的死亡率约为51%（约49 000例），约40%归因于IA；肺结核合并CPA患者发病后第一年死亡率约为20%，5年死亡率约为50%，归因死亡率约为4.8%-85.7%；念珠菌病发病率为每10万人中8.05例，治疗后的念珠菌血症死亡率约为35%，未治疗的念珠菌血症死亡率约为90%。因此可见，无论免疫低下人群或是慢性感染患者，最终真菌的归因死亡率都不低。

在临床实践中，不同科室的侵袭性真菌病（IFD）患者的病死率表现出一定的差异性。尽管血液恶性肿瘤患者、呼吸重症患者以及实体器官移植受者这三大主要群体之间在发病率和病死率上存在一定的差异，但具体到各个病种，这些差异仍然显著。

过去的研究报告曾指出，血液恶性肿瘤患者若并发IFD，其相关死亡率可能高达29-90%[2]。另一项研究针对血液恶性肿瘤患者发现，那些并发IFD的患者在三个月内的死亡率为16%，而一年内的死亡率则上升至43%[3]。在重症流感患者的研究中，发现重症流感合并IA的患者死亡率高达51%[4]，这一数字显著高于未合并IA患者的28%。此外，有研究显示，器官移植（SOT）受者在合并IFD后三个月内的死亡率为34.1%。在这些器官移植受者中，肝移植受者合并IFD的三个月死亡率相对最高，而肺移植受者则相对最低[5]。

不同检测方法的局限性会影响诊断结果的准确度，从而导致患者生存率不同。如：1、影像学检测。影像学表现多样，且霉菌感染患者常为非特异性表现，不同疾病患者、不同疾病阶段患者影像学表现不同[6-8]；2、镜检/培养。镜检虽然能快速诊断，但阳性率低，存在假阴性[9]，而培养可明确致病菌种，但需要侵袭性操作、耗时较长、敏感性不高[9-10]；3、血清学检测。G试验：IFD初筛方法，但无法区分菌种，存在假阳性[11-13]。GM试验：诊断IA敏感性、特异性高；但结果差异大[14-15]；4、分子生物学检测。PCR检测：敏感性和特异性较高。不同实验室引物、反应条件、仪器不同会影响敏感性和特异性[9]。测序技术：需要专业知识以便准确筛选出较好的真菌信息[9]。

侵袭性曲霉病的“精准诊断之路”……从真菌感染分子诊断1.0时代到真菌感染分子诊断2.0时代

近年来，我们一直在探讨如何实现精准医学诊断的实现途径。根据临床实验室的反馈，分子诊断对于肺孢子菌、隐球菌和曲霉菌的检测显示出“正向反馈”。但需要提醒临床医生的是，一定不要忽视基础的PCR原理。如果不明确核酸检测序列的基本原则，很可能会导致判断和结论出现偏差。

2019年发布的《临床微生物实验室真菌检测能力建设基本要求专家共识》，该共识旨在为国家卫健委建立全国真菌病监测网。2019年年底，全国各省都有全国真菌病监测实验室，因此当时提出了一些基本要求，比如将基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪和分子诊断平台：PCR扩增仪、测序仪等作为建议配置，因为当时真菌实验室能力不强。同期，在国际上，美国的临床和实验室标准研究所（MM18）也发布了相关的指南。

主要问题在于，通过培养得到的纯菌落无法保证其为标准样本。最初，实验室也采用纯菌进行研究。当分离出一种菌时，会通过形态学特征进行初步鉴定，例如识别基本的烟曲霉或肺孢子菌，并结合病理学分析以及染色技术。然而，对于众多丝状真菌，仅凭形态学特征往往难以确定其种属。因此，采用分子检测技术来区分不同种属真菌的过程中，靶向基因的概念是不可或缺的。

值得注意的是，经典教材[16]中提及的这些区域，被视为用于真菌种类鉴定的固有保守区域。

关于二代测序，许多临床医生常常提出有关曲霉属复合群的问题。过去当我们仅依赖于ITS序列进行鉴定时，可能会遇到无法将某些菌种归入特定组的情况。如今“组”的概念已经明确，并且引入了其他靶标序列，这些新增的靶标与ITS序列相结合，形成了具有特异性的靶位，使我们能够进行更为精确的菌种鉴定。

既然能够利用分子技术对真菌的进化分类进行重新划分，它们必然就拥有相应的特征性靶基因。这是接下来探讨二代测序技术在近缘物种研究中必须掌握的基础知识，否则便无法理解为何这些近缘物种会有相同的名称。

[17].Clin Infect Dis. 20

21 Mar 12;72(Suppl 2):S95-S101. 

随着真菌感染分子诊断技术的持续发展，我们已经从1.0时代步入了2.0时代。之所以称之为“2.0”时代，是因为它与2020年发布的权威指南紧密相连。以往，无论是国内还是国际的指南，对于直接对标本进行PCR检测的建议都较为谨慎。但在2020年，我们发现指南特别突出了对PCR的推荐，并详细解释了推荐的理由及其科学依据。从循证医学的视角来看，这些修订的来源和依据都值得我们深入探究。

在进行标本直接检测时，ESCMID和ATS均推荐使用支气管肺泡灌洗液（BALF）。对于高风险群体，如血液科患者，在缺乏预防性治疗的情况下，建议采集血液样本，并进行突变耐药基因检测，特别是针对CYP51A耐药突变的检测。

关于分子生物学检测（PCI、测序）：

确诊标准——在检出真菌菌丝的福尔马林固定石蜡包埋组织中用PCR和DNA测序检测到真菌DNA。

临床诊断标准——1）血浆、血清或全血连续2次或以上PCR检测阳性； 

2）BAL液重复2次或以上PCR检测阳性；

3）血浆、血清或全血至少1次PCR检测阳性，同时BAL液至少1次PCR检测阳性。

截至目前，2024年最新ICU指南强调，手术组织或细针穿刺提取的DNA是分子生物学检测的确诊标准。分子生物学检测的优势在于，一方面，PCR具有较高的敏感性；另一方面，测序技术能够检测出多种真菌，无需预先设定，即可报告菌种。然而，它也存在一些缺陷，例如，某些真菌如曲霉菌和隐球菌的细胞壁较厚，使得核酸提取变得困难，且容易受到污染。此外，缺乏标准化的操作技术和评估方案，以及无法区分病原菌是感染还是定植，这些都是我们在分子医学领域特别关注的问题。

无论临床医生还是实验室医生，都必须认识到样本选择和采集的重要性。首先，必须明确希望诊断的疾病类型，这将决定选择何种样本；其次，必须考虑在确定了样本类型后，如何进行样本的采集和运输。在这一过程中，对于核酸检测，无论是采用PCR技术还是二代测序技术，除了组织样本外，肺泡灌洗液无疑是最佳选择。

痰液的采集：

1、采用无菌痰液样本收集盒或无菌螺口管；

2、样本量一般在3-5mL，尽量为肺部深咳痰；

3、避免唾液样本，如不合格需要重新采样。

肺泡灌洗液：

1、采用无菌螺口管收集；

2、患者肺泡灌洗液样本应，样本量不少于3mL,若采样不合格，需取样后重新送检。

通常情况下，除非别无选择，否则都不推荐采集痰液样本。在必须进行采集时，应确保取得的是深部痰液，以避免唾液污染，这一点已广为人知。

关于样本的运输与保存，首选使用泡沫箱配合干冰进行运输，以防止样本反复冻融，特别是在运输时间超过三天的情况下。在高温季节，若运输时间不超过三天，建议使用泡沫箱加冰密封运输，并适当增加冰量。样本应尽快进行检测，置于室温下不得超过六小时；在2-8℃的条件下，样本可保存长达72小时；在-20±5℃的环境下，样本的保存期限可达12个月；而在-90到-70℃的超低温条件下，样本可保存长达24个月。对于已经冻存的样本，若需反复冻融，应确保充分混匀，尽量避免超过五次的反复冻融。

特别需要强调运输和保存的重要性，尤其是在处理血浆保存时。我们是否也曾经在没有独立判断的情况下，接受第三方提供的结果，却发现这些结果并不准确？因此，了解这些错误背后的原因至关重要。如果血样中的DNA未能妥善保存，就可能导致假阴性的结果。

当样本抵达实验室，首要步骤便是进行核酸提取。为了确保提取过程顺利，必须提供充足的高质量DNA，并尽可能地排除抑制化合物。研究表明，全血样本应使用EDTA作为抗凝剂，并且体积不得少于3毫升；血清或血浆样本则需至少0.5毫升，而核酸洗脱体积应控制在100微升以下。相较于全血，血清中提取的核酸具有更高的特异性，但其敏感性较低；而血浆样本的敏感性虽然与全血相当，但特异性却较低。若怀疑样本中含有真菌，必须通过机械破碎真菌细胞，以确保核酸提取的有效性；对于某些粘稠的BALF（支气管肺泡灌洗液）或痰液样本，在核酸提取前需要进行液化处理[17]。

以上概述了实验室的完整工作流程。无论进行PCI检测还是二代测序，核酸提取环节的针对性优化至关重要。一个优秀的实验室在处理标本时，会向医生了解患者可能感染的病原体，例如金黄色葡萄球菌或烟曲霉等，这有助于我们调整实验室的前处理步骤。

在提取和纯化痰样本的过程中，需要经过一系列复杂的步骤，直至达到最终的DNA溶解阶段。与鼻咽拭子相比，这一流程更为复杂。我们经常讨论一个疑问：为什么鼻咽拭子样本的阳性率似乎高于痰样本？实际上，这并不一定直接反映了患者的真实状况。问题可能在于鼻咽拭子的核酸提取过程相对简单，而痰样本的核酸提取若未经过适当的处理，核酸很可能与蛋白质一同丢失。

完成提取步骤后，就进入到PCR扩增阶段。侵袭性曲霉病通常由烟曲霉引起，因此，大多数检测技术首先针对烟曲霉进行检测。曲霉PCR技术能够在属水平上针对rRNA基因进行检测，从而提高对非烟曲霉种类的检测效率；而实时定量PCR技术则能在种水平上快速鉴定曲霉，并显著降低污染风险。其定量循环（quantification Cycle, Cq）与真菌载量成正比，这有利于对阳性结果的解释。目前，侵袭性曲霉病的诊断标准是基于两次阳性PCR结果，最新的综述表明，两次连续阳性结果的总敏感性/总特异性为60%/95%。BALF曲霉PCR检测具有高特异性（94%-95%），以及高阳性似然比（＞12），使其适用于确诊感染。Cq值与样本中的真菌载量成正比，这有助于设定阈值，以区分感染、定植或污染[17]。

筛查or诊断？……血PCR检测：诊断侵袭性曲霉病的可靠标准；BALF PCR检测：诊断免疫缺陷患者IA具有较高的准确性

一项荟萃分析显示，采用曲霉PCR技术筛查血液样本，其敏感性介于84%至88%之间，特异性则在75%至76%的范围内[18-19]。在最新的Cochrane综述中，血液曲霉PCR检测的统计数据也呈现了相似的结果（敏感性为79%；特异性为80%）[20]。在诊断侵袭性曲霉病（IA）患者时，感染部位的样本相较于血液样本更具诊断价值；当同时对支气管肺泡灌洗液（BALF）和血液样本进行曲霉PCR检测时，BALF的PCR敏感性（63%）明显高于血液样本（8%）。结合抗原检测，曲霉PCR的性能达到最佳。一项研究显示，将PCR与半乳甘露聚糖（GM）检测（I>1.0）相结合应用于BALF样本，其敏感性可达100%，特异性为98%[21-22]。

明确检验的目的对于评估检验结果的价值至关重要。例如，在筛查过程中，面对血液科患者，需要通过血液样本检查来确定是否存在高风险的曲霉感染的可能性；而在诊断阶段，如果影像学检查怀疑患者患有曲霉病，那么在诊断感染部位时，支气管肺泡灌洗液（BALF）的样本相较于血液样本将更具诊断意义。

[23].Arvanitis M et a

l. J Clin Microbiol. 2014 Oct;52(10):3731-42

血PCR检测：诊断侵袭性曲霉病的可靠标准。25项研究的荟萃分析：血清PCR检测的敏感性和特异性分别为84%和76%；至少有两次PCR检测结果阳性时的特异性则高达95%，敏感性为64%，两次PCR阳性结果应该被认为是高度提示活动性曲霉感染的指标[23]。

 [24].Sun W

 et al. PLoS One. 2011;6(12):e28467.

BALF PCR检测：诊断免疫缺陷患者IA具有较高的准确性。17项研究1191例高危患者进行荟萃分析：BALF-PCR检测诊断确诊及临床诊断IA的敏感性及特异性分别达91%和92%；亚组分析结果表明，PCR检测方法、引物设计、细胞壁破坏和DNA提取方法均对检测结果有一定影响[24]。

[25]. Mikulska

 M et al. Crit Care . 2010;14(6):R222.[26].施毅等. 中华结核和呼吸杂志. 2019;42(7):500-506.[27].Arvanitis M et al. Clin Infect Dis. 2015;61(8):1263-72.

这篇文章的结果高于任何单一事件，即IFD的诊断进展，多元方法的综合运用进一步提升了早期诊断准确性。特别强调了血清学和分子生物学，将GM与PCR阳性结果结合起来。这种血清学联合分子生物学检测具有较高的诊断阳性：至少1个GM或PCR阳性结果确定阳性的敏感性高达99%，且结果显著高于任何单一试验（与GM试验相比，P = 0.0018；与PCR相比，P<0.0001）[25-27]。

[28].Mah J et al. C

lin Infect Dis. 2023 Jul 14:ciad420. doi: 10.1093/cid/ciad420. PMID: 37450614.

2023年的最新CID研究也成功完成了这一任务。在诊断侵袭性曲霉病方面，曲霉菌血浆游离DNA PCR技术已经证明比血清半乳甘露聚糖检测更为优越。这项研究在2020至2022年期间，对238名免疫功能受损且疑似患有侵袭性真菌病(IFD)的患者进行了测试。结果显示，在造血干细胞移植患者中，循环游离DNA PCR的敏感性优于血清GM检测（92%对比67.9%，p<0.05）。研究还指出，将血浆PCR与血清GM检测结合使用，在新诊断的侵袭性曲霉病(IA)患者中，敏感性达到了100%。然而，研究者特别强调，这一发现并非用于筛查目的，并用星号特别标记[28]。

有时候可能临床医生会奇怪，为何PCR检测报告了很多阳性结果。有一点需要知道：分子生物学的目的并非用于筛查，而是为了确诊。换言之，PCR的使用是为了提高诊断的阳性率，并非仅凭PCR阳性结果就做出诊断，两者之间存在本质的区别。

从国内商品化试剂的可及性、EORTC 曲霉分子诊断展望到病原体宏基因组检测（mNGS）……浅析国内指南共识

在探讨国内商品化试剂的可及性时，以肺部真菌的分子诊断为例，众多大型医院已实施了包括曲霉、隐球菌和肺孢子菌在内的三联检测。然而，必须重申的是，对于肺孢子菌在内的病原体，仅凭核酸阳性结果便急于进行检测是不恰当的。至少需要影像学的支持，并且患者存在易感因素，才可能考虑进行检测。分子生物学检测应当在怀疑或疑似诊断的情况下谨慎进行，目的是为了辅助我们达到临床诊断的水平，而非作为筛查手段。我个人最担忧的是，分子生物学检测的过度使用可能会导致这一技术失去其应有的价值。

如果检测中已确认了曲霉菌的存在，接下来可以进行分型鉴别诊断以及耐药基因检测。近期，耳念珠菌也引起了广泛关注，将耳念珠菌纳入医院感染筛查十分有必要，尤其是对于ICU的高风险患者或血液科患者而言，耳念珠菌可能导致他们的院内感染。

随着二代测序（NGS）技术的飞速进步，未来有望利用NGS技术直接从临床样本中检测并识别真菌种类，甚至在真菌群落内部实现精确鉴定，并能够确定抗真菌药物的敏感性和基因型。这是我们对EORTC曲霉分子诊断未来的展望。考虑到分子方法在研究呼吸道真菌群落复杂性时面临的挑战，特别是由于某些共生或定植菌种/属的大量存在，可能会干扰对具有临床意义的真菌的检测，因此NGS方法还需要进一步的优化以减少漏诊的风险。数字液滴曲霉PCR技术能够定量检测真菌，并且具有更高的灵敏度，这一技术的突破令人鼓舞[17]。

近年来，病原体宏基因组检测（mNGS）可直接从痰液、支气管肺泡灌洗液(BALF)、血液、脑脊液(CSF)、胸水、腹水、脓液和组织样本中提取微生物核酸，无需培养与假设，理论上可检测到所有已知基因组序列的病原体。与传统方法相比，mNGS的一个突出优势在于其检出率一般不会受到先前抗菌治疗的影响。因此，在准确诊断和治疗临床感染性疾病方面具有很高的潜在应用价值[29]。

最近mNGS取得了新的进展，例如：缩短周转时间，减少外源性污染，改进工作流程和提高敏感性。基于第二代测序的Illumina测序法对真菌的检测敏感性和特异性分别为91%和89%；基于第三代测序的纳米孔测序法对真菌的检测敏感性和特异性分别为91%和100%[29]。

[30].Park 

SY et al J Clin Microbiol. 2023 Aug 23;61(8):e0185522. PMID: 37439686; PMCID: PMC10446866. Hill et al. Clin Infect Dis, 2021:e3876-e3883.

国际上，去年发表的这篇文章回顾了与新冠病毒相关的肺曲霉病病例。该研究覆盖了2018年至2021年期间的约18,000个血浆样本，其中使用血浆游离DNA的检测方法显示了83%的敏感性和97%的特异性。值得注意的是，该实验室是第三方机构，因此其操作流程，包括样本采集、运输以及后续的诊断程序，都严格遵守规范[30]。

这是国内专家的共识。在国内进行高通量测序时，我们的样本量远超美国，中国在这一领域的临床实践走在了国际前沿。然而，我们是否已经积累了足够的优质数据和研究成果来支持这些指南？目前，这方面的建设仍在持续进步中。

今年4月，我们组织了病原宏基因组高通量测序的本地化工作。为何要特别强调本地化？这是因为外送样本存在一系列问题，导致临床对结果的信任度存在诸多疑问。因此，如果采用本地化方式，本地化与外送有何区别？从实验室建设到数据分析，我们特别强调临床解读必须有临床专家的参与，否则不能称之为真正的临床解读，而这些都是正在不断探索的新问题。

[31].徐英春, 瞿介明. 成人呼吸

道感染病原诊断核酸检测技术临床应用专家共识（2023）[J]. 协和医学杂志. doi: 10.12290/xhyxzz.2023-0338

《成人呼吸道感染病原诊断核酸检测技术临床应用专家共识》针对呼吸疾病患者的应用场景进行了详细阐述，例如，在流行季节急性上呼吸道感染应如何妥善处理等等。我们应关注发热门诊的现状，尤其新冠疫情后，许多发热门诊失去了独立性，这导致了无法迅速进行检测，而发热门诊的病原体核酸快速检测尤为关键，它充当着我们的“哨点”和“第一道防线”，如果“哨点”失效，患者在进入ICU之前很可能已经发展为重症，如何迅速“识别”这些重症患者至关重要[31]。

对于免疫功能正常且存在住院风险的支气管炎患者，推荐使用多重PCR技术；还包括社区获得性肺炎（CAP）患者的处理方法，以及免疫功能正常患者的具体处理措施等[31]。

侵袭性真菌病真菌学检查指南的推荐意见[32]：PCR检测技术可在较短的时间内检测真菌DNA，有利于IFD的早期诊断。

① 推荐对真菌PCR检测的试剂、耗材进行性能验证，对结果进行全过程质量控制；

② 对于临床样本含有低丰度的真菌DNA或涂片可见真菌成分，但培养阴性时， 建议采用已验证过的 PCR方法对临床样本进行检测；

③ 对于念珠菌血流感染，建议对全血液样本进行念珠菌通用PCR检测。该检测项目可用于念珠菌菌血症的排除诊断（弱，低）。对于耶氏肺孢子菌肺炎，建议对呼吸道样本进行PCR检测。（弱，低）

④ 对于肺曲霉感染，建议对血液样本（全血、血清、血浆）、BALF进行曲霉通用PCR检测（弱，低）

⑤ 对于肺毛霉感染，建议对BALF、血清进行PCR检测（弱，低）。对于组织毛霉感染，建议对新鲜组织或福尔马林固定和石蜡包埋组织样本进行PCR检测。

真菌和细菌最大的区别在哪里？从病原微生物的角度来看，细菌的通用性较强，只需要16s即可。真菌细菌与病毒接近，然而对于真菌、念珠菌、曲霉和毛霉的检测方法可能不同，并非仅检测念珠菌就可以解决其他丝状真菌的问题。

侵袭性真菌病真菌学检查指南[32]：mNGS应用推荐

推荐意见1：应用范围为：免疫功能低下或重症IFD、疑难IFD、对侵入性手术不耐受的IFD；

推荐意见2：报告解读除关注检测出病原真菌的特异性序列数和基因组覆盖度之外，一定要结合临床表现、影像学、宿主因素、微生物其他检测结果、其他间接性感染性指标等综合判断；

推荐意见3：鉴于毛霉目真菌培养阳性率低、血清学G和GM试验不能覆盖，对于免疫受损患者（如造血干细胞移植）高度怀疑毛霉目真菌感染时，可在送检真菌涂片和培养的同时，同时送检血或感染部位标本的mNGS检测；

推荐意见4：耶氏肺孢子菌可在呼吸道定植，判读其mNGS结果时需结合临床表现、影像学、宿主因素、G试验、LDH等综合判断；

推荐意见5：鉴于荚膜组织胞浆菌、马尔尼菲蓝状菌和利什曼原虫在组织病理中难以区分，在非流行区组织病理怀疑以上病原体时，mNGS检测可作为辅助病原学诊断手段之一；

推荐意见6：BALF mNGS测出少量隐球菌的序列，应参考外周血或BALF隐球菌荚膜多糖抗原检测结果；

推荐意见7：BALF mNGS测出少量曲霉序列，应参考BALF GM试验结果。（结合影像学）；

推荐意见8：mNGS 在 IFD 病原学诊断中的技术问题包括：高成本、人类宿主背景的影响、外源微生物污染、厚壁真菌核酸提取效率低（尤其是隐球菌）等；

推荐意见9：mNGS应用于IFD病原学诊断的流程亟需标准化。

对mNGS的推荐列表中，毛霉、耶氏肺孢子菌、荚膜组织胞浆菌、隐球菌、曲霉，每一种病原体均单独列出[32]。若每种病原体均单独列出，这无疑会给临床医生带来挑战，他们必须首先预测可能的病原体，以便进行准确的识别。常言道：“预见方能遇见。”若缺乏预见性，可能难以发现这些病原体。

mNGS的风险评估和质量控制比普通的情况复杂。共识中也提到了mNGS标本的选择和采集：

当前，人们热衷于探讨“局限性”，比如哪些是不适宜进行mNGS检测的样本。因此共识也进行了详尽的列举。

在技术领域，前端的样本选择与后端的数据分析。我曾这样描述：功夫在诗外。这表明，我们不能仅仅依赖书本知识得出结论，而是必须通过深入审阅大量临床病例，积累实践经验。

这是一个很经典的案例，今年春天的社区获得性肺炎。该病例是偏肺病毒、甲流病毒合并曲霉。这位急诊的患者来到医院，通过质谱和二代测序，培养出来的结论就是图中看到的这些情况。

还有社区-医院的相关性肺炎，嗜肺军团菌的肺部感染。患者进入ICU以后，脱离ECMO后继发曲霉和肺克的情况并不少见。因此从社区-医院环境来看要主要区分免疫正常和免疫受损的患者。

[33].Ma X, et al. 

Front Med (Lausanne). 2022;24;9:751617. 

从血液病患者来看，血液病患者可以通过血浆游离DNA检测mNGS来诊断IPA[33]。

同时在非粒缺患者中，上海长征医院发布的一篇文章，他们将血液和BALF联合起来以提高它的特异性。BALF可能是敏感性，血液是特异性，二者结合起来能提高诊断效能。

[34].Schmitz JE, 

Stratton CW, Persing DH, Tang Y. Forty Years of Molecular Diagnostics for Infectious Diseases. J Clin Microbiol 2022;60.

感染性疾病，包括尤其是真菌的分子诊断的可及性，实际上这种可及性更多不是讲技术的可及性，而是诊断的可及性。当检出核酸阳性，并不等同于是致病的，同时对于二代测序而言，Reads最多也并不一定就是致病因素[34]。比如有人提到“Reads数量排名前二就报。”实际上，解读规则在不断更新的过程中，这些都是需要考虑的问题。

多元化发展的方向可能就是刚才提到的技术。每个技术都有其优势和缺点，如何应用？尤其在不同人群和治疗的不同周期，无论是早期还是晚期，诊断或者疗效评价，都会有所不同。

现在对真菌也有一些tNGS作为靶标性。因为做普通mNGS可能比细菌序列数少很多，临床医生有时候难以分辨清楚2条序列如何与1万条序列比较。因此，tNGS似乎能够从某种程度上解决临床（尤其基层医生）的问题，但仍然远远不够。

这张图片来自国外，但实际上国内企业也在进行这项工作。他们将前面的DNA的提取、文库的构建和模板的制备变成一个POCT，也就是说在一个封闭的空间内2次把tNGS的污染控制住。如果该问题没有解决，现在的tNGS仍然会给临床带来很多误读。如果在不久的将来能够将这个环节真正克服，将其打造成密闭的空间，完成前三个步骤，那么接下来的测序和结果解读，我相信通过现有方案就可以更好地应用这项技术。

[35].Inte

nsive Care Med. 2024 Mar 21.

今年年初（3月份），七大学会发表了关于侵袭性真菌感染在成人ICU的最新指南，即“One world,One guideline,One definition.”[35]

该思路一经发布，便吸引了众多关注。我们注意到，相较于2020年版本，它似乎有所退步。确诊过程本身并未出现重大问题，主要挑战在于临床诊断方面。目前，该思路所依赖的微生物学证据主要为培养、血清GM实验以及支气管肺泡灌洗液（BALF）GM实验。然而，由于全球各国情况的差异，新技术的应用和开发也呈现出多样性。此外，我们还需反思是否存在过度诊断的问题。理想与现实之间仍存在差距，我认为目前最为关键的是保持良好的沟通。毕竟，所有技术的应用最终都依赖于沟通的效果。只有持续进行多学科团队（MDT）讨论，结合病情的进展，并与公共卫生事件相结合，我们才能实现更精准的诊疗。

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专家介绍

吴文娟

同济大学教授、博士生导师，上海市东方医院南院检验科主任，中国女医师协会检验医学会分会副主任委员，中华医学会检验医学分会微生物学组委员，中国合格评定国家认可委员会主任评审员，国家卫生健康委药敏标准委员会专家委员，国家卫生健康委全国真菌病监测网专家委员，上海市微生物学会临床微生物学专业委员会主任委员，上海市医学会分子诊断专科分会副主任委员，上海市医学会检验医学专科分会微生物学组组长。研究方向：病原微生物快速检测及耐药机制研究、医院感染控制等。主持国家科技重大专项课题2项、国家自然科学基金4项、省市级课题和人才计划20余项，发表论文140余篇，编写行业标准、专著10余项，授权专利6项。

本文由《呼吸界》编辑 冬雪凝 整理自第16届瑞金呼吸疾病学术论坛，感谢吴文娟教授的审阅修改！

* 文章仅供医疗卫生相关从业者阅读参考

本文完

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