呼吸道感染病原学诊断是非常重要的基础，尤其对于一些重症、发展较快、初次经验性治疗效果不佳的患者，病原学诊断显得更加重要，它提供了第一手资讯，为我们更加有效的治疗提供了重要基础。我与大家交流的内容分为三个部分，第一部分，不同类型肺炎的病原谱；第二部分，呼吸道病原体传统诊断方法；第三部分，新型呼吸道病原体诊断技术。

一、不同类型肺炎的病原谱

在我国社区获得性肺炎（CAP）的病原谱分布中，病原体种类繁杂，人群分布差异大，成人和儿童略有区别，总体来看，成人最多见的是肺炎支原体、甲流、肺炎链球菌，这是新冠疫情流行前国内相关研究的结果，现在新冠乙类乙管后，可能会对病毒类呼吸道感染引起的社区获得性肺炎的病原谱产生些影响。在儿童中，较多的是肺炎支原体、呼吸道合胞病毒和肺炎链球菌，与成人的病原谱略有区别，流感在儿童中也比较常见。

这是我牵头做的中国重症社区获得性肺炎（SCAP）全国多中心的流调结果，在成人中得出的结论是最多见的病原为流感、链球菌、肠杆菌。有人问，肠杆菌科细菌为何在社区获得性肺炎中存在？因为我们讨论的是“重症社区获得性肺炎”，这些患者中肠杆菌还是很多见的。从这三大病原体的季节趋势来看，流感在冬季前后流行、常见于我国北方，夏季肠杆菌科细菌较流行，另外罕见病原体变得更常见，鹦鹉热衣原体、钩端螺旋体和支原体也可以引起重症，我们应该重视。

对于中国成人重症社区获得性肺炎中，过去大家都遇到的诸多挑战，包括住院死亡率高（>22.9%）、经济负担重（每位患者46000+人民币）、不同地区、区域的致病谱不同、病原体检出率低、需谨慎鉴别区分感染与定植或污染；还有可能“即使送了病原学检查，阳性率也无法满足临床需求”。因此，我们在一项研究中采用了多种方法平行送检，进行了病原体培养、血清学抗体、尿抗原检测、PCR检测、mNGS（DNA+RNA），总阳性率得到了提高，达到72%。

我们再看看中国医院获得性肺炎（HAP）病原谱，医院获得性肺炎最常见的病原体包括鲍曼、铜绿、肺克、金葡，机械通气相关性肺炎（VAP）是医院获得性肺炎中由于使用气管插管、呼吸机导致的，或气管切开应用机械通气导致的肺炎。从病原微生物来看，VAP与HAP基本相似，而与社区获得性肺炎的病原体分布仍存在差别。

二、呼吸道病原体传统诊断方法

传统方法包括直接检测和间接检测两种。直接检测，顾名思义是直接找到病原体，包括培养方法（培养、鉴定、药敏试验）和非培养方法。培养方法主要针对细菌和真菌，但病毒及一些特殊病原体如支原体、衣原体的培养比较困难，并且时间周期较长，无法满足临床诊断需求；非培养方法主要针对病原体的抗原检测，包括酶免疫法EIA、荧光免疫法IFA，在这个阶段中，尤其近几年的新冠疫情，检测抗原的方法也被广泛应用于筛查。间接检测是指病原体感染后，患者也就是宿主产生了对病原的反应，包括血清学改变、抗体产生，可通过检测抗体EIA、IFA，间接判断是否存在感染。

1、分离培养：传统方法中的“培养”使用得非常多，它是确诊的金标准，而且细菌和真菌还可以进行药敏试验，药敏数据为我们提供针对性药物治疗提供了重要参考，它的缺点是什么？培养周期较长，通常最快速度需要36-72小时才能出现培养结果，有些甚至需要几天以上，无法完全满足临床需求；而且对培养的技术要求高，还会受到采样技术、转运条件等限制。

2、抗原检测：目前新冠以及流感，我们使用较多的是直接或者间接方法来快速诊断是否存在病原体，即检测抗原是否存在，免疫荧光方法(DFA/IFA)可作为早期快速诊断的初筛方法，但敏感性、特异性低，共同抗原会引起交叉反应，采样要求高，不规范采样易出现假阴性。

酶联免疫吸附试验ELISA多为单一病原学检测，多项目检测需多产品并用，在一个检测板、试剂盒上常常只能检测单一病原体，费时又费力，且灵敏度、特异性低。

3、抗体检测：适用于难培养的或特殊病原体的检验，如病毒、支原体、衣原体、立克次体等，优点在于采样方便，速度快，缺点有两方面，第一，敏感性、特异度较低，因此无法用于常规诊断；第二，抗体的产生存在迟缓过程，即存在窗口期，易漏检，不适用于早期诊断，只能通过后续筛查，了解整个人群中感染过某个病原体的比例，或作为辅助诊断来参考。

在呼吸道病原体传统诊断方法中，我牵头呼吸感染学组制定了肺部感染性疾病支气管肺泡灌洗病原体检测中国专家共识（2017年版），以便更好地制定SOP流程和技术标准。对支气管肺泡灌洗的采样方法，以及实验室如何处理、如何定量培养、镜检染色、标本质控，另外，离心后我们如何对沉淀物和上清液进行特殊检查？，例如显微镜下的直接镜检、特殊病原体培养、核酸检测以及真菌抗原检测都制定了详细流程。这个专家共识有很好的指导作用，发表后也受到了广泛的关注和好评。

三、新型呼吸道病原体诊断技术

这些技术相较于传统方法具有其优点和特点，如何利用这些优点和特点为呼吸道感染患者提供更快速、准确的诊断？我认为大家应该有更全面的了解。

新型呼吸道病原体诊断技术分为两大类，一类是基于核酸扩增的技术，包括PCR、RT-PCR，以及宏基因组包括二代测序等，另一大类是非基于核酸扩增，即不是检测病原体的DNA或者RNA核酸。

图：新型呼吸道病原体诊断技术一览

以下几项是在呼吸道感染病原体检测中的新型技术。这些技术无论基于核酸还是非核酸，相较于传统方法，它们具有优势和特长，同时我们也需了解它们可能存在的缺陷，以便更好地选择。

1、RT-PCR：

基于核酸检测中，使用最多的是RT-PCR，尤其在过去的三四年中，我们在新冠检测中使用得很多，影响SARS-CoV-2检测准确性的关键因素是什么？我们需要注意几个方面，首先是标本保存，有相应的特殊的病毒保存液以确保核酸不降解；第二，因为新冠病毒和流感病毒都是RNA病毒，核酸很容易降解，在运输过程中应该小于4摄氏度；第三，我们在准备期时需要做好相关工作，更好地防止降解RNA病毒的核酸；同时需要对检测试剂盒的质量做好把关；还有实验室条件，需达到P2标准实验室的标准才能进行病毒检测，特别是新冠病毒等检测；相关技术人员的培训和监督非常重要。

2、基于ddPCR的核酸检测

目前常见的数字PCR（digital PCR，dPCR）主要有两类，分别为微腔室dPCR（cdPCR）和微滴式dPCR（ddPCR），以ddPCR为例，其反应流程是通过将样品随机分散至成千上万个微反应单元（微滴）中，每个反应单元最多包含一个靶核酸分子，然后在每个微单元独立进行荧光PCR反应，扩增反应结束后收集分析各个反应单元荧光信号，通过荧光信号的有无判断每个反应单元有无靶基因，最后利用泊松分布的原理来计算样品中的核酸拷贝数。 

这样看来，对于真菌、结核分枝杆菌等包壁较厚、破壁困难的病原体可以尝试使用ddPCR，RT-PCR检测的敏感性和特异性可能无法满足临床需求，以往，真菌检测的传统方法存在诸多不足，涂片镜检操作简单，但阴性结果不能排除感染可能；真菌培养耗时长、敏感性低，可能需要多次培养，甚至无法培养；G试验不能用于接合菌和隐球菌感染的检测，无法鉴别致病菌种，具有较高的假阳性；GM试验诊断侵袭性曲霉病的敏感性为80.7%，特异性为89.2%，易受某些食物或药物的影响，假阳性率高达18％。

对于真菌来说，使用微滴式dPCR可以大幅提高它的敏感性。我们研究团队正在准备开展侵袭性真菌菌属核酸检测试剂盒（数字PCR法）的临床试验，验证其检测有效性、准确性及可靠性。

3、环介导等温扩增（LAMP）

它有4个步骤，样本采集、样本准备（溶解、提取、纯化）、上机扩增及基于荧光或颜色改变的检测。优点主要体现在该方法利用4-6个引物识别目标序列的不同区域，在恒定温度（60-65℃）下通过茎环结构进行反复扩增，以达到检测靶基因的目的，相较于PCR技术，等温扩增核酸检测简化了热循环反应过程，缩短了检测周期。

我们研究团队开发了高度敏感和特异的LAMP检测方法，用于肺炎克雷伯菌的临床鉴定和碳青霉烯类抗生素耐药性的检测：敏感性、特异性以及阳性和阴性预测值在痰样本上分别为100%、91%、90%和100%，这非常令人鼓舞。

相关研究已发表在国际期刊上。LAMP用于诊断试剂临床转化过程中有一些需注意的要点，包括优化引物设计，以及完善标本的采集、运输和储存，改进核酸提取方法等，我们认为更重要的是如何将LAMP技术更好地形成诊断试剂盒，使其在临床微生物实验室中进行呼吸道感染病原体检测时更加小型化、便捷化和简洁化。

4、基于CRISPR/Cas的核酸检测

这项成果于2018年获得世界十大科技进展，研究人员用基因剪刀技术开发“基因试纸”，CRISPR的原理为crRNA引导下实现的Cas蛋白酶核酸剪切功能，具体来说，根据病原体的基因序列可设计特异性crRNA，理论上，只要样本中存在靶向序列，crRNA就能对其进行精准识别并激活Cas蛋白酶执行报告核酸分子切割功能，使得信号分子得以释放、捕获。该检测技术通过crRNA将靶核酸的序列信息转移至可检测的信号：荧光、试纸条、生物传感器等。

在新冠疫情期间，我们研究团队对CRISPR-Cas12a检测进行了系统性的优化，开发了名为Cas12a-Linked Beam Unlocking Reaction（CALIBURN）的反应体系，可实现对包括新冠病毒在内的多种呼吸道病原体进行特异性检测，与其他病毒没有交叉，且诊断试剂盒是一次加样、一次封盖，无需开盖，可以在40分钟之内完成整个样本检测，大大提高检测时间、效率。

5、宏基因组测序（mNGS）

尽管二代测序技术本身使用得非常广泛，但如何更好地满足临床需求呢？目前，下呼吸道感染的发病率和死亡率仍然很高，机会性和耐药性病原体感染的风险也在增加，细菌检出率低，难以区分定植和感染仍是改善严重下呼吸道感染预后的阻碍，优先解决方案包括基于临床特征和实验室结果的综合解释以及标本采集/递送/保存程序的标准化。

我们感染学组与中日医院曹彬教授共同在《中华结核呼吸杂志》发表了下呼吸道感染宏基因组二代测序报告临床解读路径专家共识，从流程图中（下图）我们可以看到，如果阳性结果明确为致病病原体，我们就根据结果进行治疗；若是可疑致病病原体，我们需要进行病情评估。对于重症和危重症患者可以根据结果进行调整治疗，寻找其他依据；对于非重症患者，我们可以不根据结果进行调整，治疗效果良好的患者可以继续治疗。

另外，如果排除了致病病原体，需寻找其他原因，阴性结果需要考虑非感染性疾病，要治疗原发病；对于强烈怀疑感染性疾病，我们需要进一步分析，包括分析背景微生物、原始或其他病原学检测结果，看看能否在进一步分析的基础上确定致病病原体，如不能，再组织相关MDT多学科的会诊等。

无论如何，从mNGS未来技术发展角度，我们还需要在以下7个方面进一步提升：首先，在标本检测过程中加入内参核酸，以进一步定量分析丰度变化；其次，减少实验操作中的过度扩增及污染；第三，对于厚壁病原体，如真菌、分枝杆菌等，需要优化破壁技术；第四，优化和创新去宿主DNA方法，提高低拷贝病原体的检出率；第五，联合病原及宿主转录组数据，判断定植与感染；第六，提高报告的可读性，报告应简洁明了，明确提示可疑致病病原体、污染菌、背景菌或者条件致病菌等；第七，应在未来构建临床信息-药敏数据-测序信息的综合大型数据库。

6、侧流免疫层析 (LFIC)

这是非核酸新型检测方法中使用最多的，将硝酸纤维膜上的胶体金偶联了特异性抗体，倒过来检测抗原，这样可以快速解读结果，特异性较高，对设备要求低，操作成本低，基本不需要额外的样本预处理；在改进方面，我们应进一步加强荧光检测强度，以提高结果判断的客观性。

目前使用较多的为纤维膜试剂条，如果荧光检测强度进一步增强，肉眼可以更好地观测。以侧流免疫层析为例，我们可以用于检测甲流、乙流、呼吸道合胞病毒，甚至检测碳青霉烯耐药基因是否存在，我们都可以像用试剂棒一样对照和测试，观察为阳性或阴性。目前它最大的局限性是多为单重检测。

7、不依赖测序的耐药性确定方法

基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI–TOF-MS）目前在临床上未广泛应用于下呼吸道病原体的临床检测，但这是未来的方向之一，目前我们主要用于研究方面，例如，对于金黄色葡萄球菌，为了检测抗菌药物是否敏感，可以采用相关测试方法，事实上，它每次检测都可以在较短时间内完成，基本可以在一天内能够鉴定标本菌株、得出药敏结果。不依赖测序的耐药性检测在是从病原学诊断和检测角度来看是很好的方法，但缺点在于，它需要对不同细菌建立相应的数据库，这也是未能广泛应用的原因。

未来这类项技术可以基于微流控的技术，观察不同抗生素条件下的细菌形态变化，如肿胀、鞭毛丝生成，针对不同病原体使用不同抗菌药物，在较短时间内可以做出更多耐药性检测。

参考文献

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专家介绍

瞿介明

医学博士，主任医师，二级教授，博士研究生导师，上海交通大学医学院附属瑞金医院党委书记。中华医学会呼吸病学分会主任委员、中国医师协会呼吸医师分会副会长、上海市医师协会呼吸内科医师分会会长、上海市医学会呼吸病学专科分会第十届主任委员、上海市呼吸感染性疾病应急防控与诊治重点实验室主任、上海交通大学医学院呼吸病研究所所长等。研究方向及成果：呼吸系统感染性疾病的病原学机制及呼吸系统危重症的干预、机制探索及临床应用研究。作为负责人承担国家自然科学基金项目、科技部国家重点研发项目、科技部国家重点基础研究子课题等十余项课题。获上海市科技奖进步一等奖，国家教育部科技进步二等奖、上海市科技进步二等奖等科技成果奖，在cell、the Lancet、BMJ、Cell Research等国际权威杂志作为第一和通讯作者发表SCI论文130余篇，IF 1100余分，他引2万余次，主编或者副主编10部专著。

* 本次系列直播由中日医院呼吸与危重症医学科主任助理王一民医生主持。

本文由《呼吸界》编辑 Jerry 整理，感谢瞿介明教授的审阅修改！

感谢罗氏制药对本季直播的大力支持

本文完

责编：Jerry