侵袭性真菌感染是患者发病和死亡的重要原因。早期诊断是一项艰巨的挑战，对于提高生存率具有重要意义。临床微生物与感染杂志（Clinical Microbiology and Infection）于2023年发表了一篇题为如何使用直接镜检法诊断真菌感染的综述文章，对于真菌感染的直接镜检提供了有用的建议，我们对此综述进行部分翻译汇总，以优化直接镜检操作及报告流程，促进真菌感染的早期诊断。

问题1. 为什么我们要使用直接镜检？

培养和镜检仍然是「金标准」，尽管其可能敏感度不高，且取决于患者人群和标本类型。因此，基于分子和抗原的方法在诊断真菌感染中应用越来越多，它们的敏感性和特异性也各不相同。在解释抗原、PCR、抗体和真菌代谢物结果时需要谨慎。COVID-19相关肺曲霉病在不同医院和国家之间发病率存在高度差异（发病率分别为3%-33%），这一现象与诊断差异有关；目前，来自培养、镜检和生物标志物的阳性结果可纳入侵袭性真菌感染的临床诊断（probable）定义。阳性判断缺乏统一标准可导致真菌感染诊断的不准确。例如，曲霉分生孢子的存在可导致培养阳性，镜检阴性，这意味着培养阳性并不等同于侵袭性感染。真菌镜检对基于证据的诊断分类是必须的，而且对于判断培养阳性的临床意义也是必须的。如果在无菌标本中真菌直接镜检阳性，则可证实感染，而与培养和其他基于分子的证据无关。

问题2. 直接镜检的最佳方法是什么？

临床微生物实验室常使用氢氧化钾(KOH)、印度墨汁、荧光染料和革兰染液进行直接镜检（特征如表1所示）。直接镜检前应首先检查标本有无坏死、脓性、血性或干酪样区域，这些是最有可能看到真菌的部位。建议用液体样本进行离心浓缩，并对沉淀进行直接镜检。革兰染色不推荐作为真菌特定的染色首选方法。荧光染色因其灵敏度高与快速已被广泛使用。

问题3. 直接镜检：找到形态学的关键区分因素

特定结构有助于判断病原（如表2）。酵母样细胞、出芽、菌丝（有分隔或少有或无分隔）、假菌丝在理想的情况下是可以区分的。曲霉的典型特征是具有二分叉分枝、规则的具有分隔的菌丝，而毛霉则是宽大、无隔膜或少分隔的不规则分枝的菌丝。在任何情况下，种属的确定仍然需要培养或分子的手段。尽管直接镜检具有高度价值，但其可存在假阴性，即镜检阴性不能除外真菌感染。真菌镜检的最大价值在于阳性结果（主要是无菌部位或感染部位样本）可以证实感染。此外，需要注意的是，一旦已经使用了抗真菌治疗，真菌形态会发生改变。

表2. 常见真菌直接镜检的典型形态

问题4. 直接镜检应选择什么样本？

在可能的情况下，最重要的环节是从感染部位采集标本；此外，从疑似有侵袭性真菌感染患者获取的所有原始无菌标本都需要进行显微镜检查。表3提供了重要的真菌种类及其在临床标本中检出情况的概述。支气管肺泡灌洗液和肺活检样本是诊断侵袭性肺部感染的首选标本；而气管分泌物或痰液则不太具有代表性。相反，在过敏性支气管肺曲霉病中，痰液检查有助于诊断，因为往往可以看到嗜酸性粒细胞和夏科-雷登结晶。

表3. 真菌及其在临床标本中的重要性和检出情况。

注：真菌检出分类从-（通常不存在）到+（低频或不太重要）到+++++（高频检出或高度重要）。a 双相真菌具有地域分布特征，各类标本中的真菌结构可能为这些病原所引起；b 只有土曲霉；c 尖端赛多孢；d 多育节荚孢。

问题5. 直接镜检容易出现的陷阱有哪些？从假阳性结果到人员错误

真菌镜检的成功取决于人员的专业知识、取材部位、样本量、病理部位以及涂片的精心制备。例如，脑脊液真菌镜检需要离心浓缩。其次，真菌比细菌大，但通常数目较少，且呈团簇存在，所以镜检需要检查涂片的多个部位。此外，真菌镜检无法区分是否为存活与死亡的真菌。KOH可与脓液、皮肤组织或痰液反应，可形成类似菌丝或出芽酵母的形态，如图1；脑脊液墨汁染色中淋巴细胞可能会被误认为隐球菌，纤维可被当做毛霉目真菌。应由另外一位有经验的检查者对模棱两可的结果进行复审。

图1.不同来源标本的直接镜检中真菌病原体特征以及可能遇到的问题

问题6. 报告真菌成分的最佳实践建议

报告真菌成分的最佳建议取决于标本和感染类型，必须仔细解读。第一步是确保样本的数量和质量，选择正确的方法检测疑似真菌病原体。报告结果应包括以下真菌形态：酵母菌是大还是小，是否存在分隔、出芽、假菌丝；菌丝是否有分隔，形态结构特征；最后，是否有色素沉着，是否存在小的细胞内酵母细胞，见表2。与酵母菌相比，暗色丝状真菌更容易因感染器官、菌丝生长时间和宿主的炎症反应而发生形态改变。图2给出了一个简单的步骤流程图，用于解释真菌成分。

图2.直接镜检中真菌成分判读流程图

呼吸道标本中最常见的真菌包括曲霉菌，念珠菌及耶氏肺孢子菌。BALF中可见分隔菌丝高度提示真菌感染，应立即报告给临床医生，确保及时进行抗真菌治疗。由于直接镜检无法区分曲霉、赛多孢和镰刀菌等，应报告为「曲霉样」或「分隔菌丝」，见图1。分子方法可以快速的进行种属鉴定。镜下发现肺孢子菌也应及时报告给临床医生，同时，分子方法也可以帮助诊断。许多种类的丝状真菌、酵母菌都可能参与眼睛和鼻窦感染，任何提示真菌的镜检结果都应及时报告给临床医生。镜下可见宽的无分隔或少分隔菌丝可提示毛霉菌目，应立即报告临床。除了隐球菌抗原检测外，还建议对免疫功能低下患者的脑脊液样本进行离心后墨汁染色，在接受治疗的患者中，脑脊液墨汁染色阳性，只有在患者临床状况恶化或培养阳性的情况下才可被视为治疗失败或复发的证据。此外，血培养直接镜检可以加快诊断流程和鉴定后的治疗。如果不能识别特征形态，至少报告「真菌成分」的存在。这确保了医生可根据具体情况做出决定。复核原则在某些情况下可能是有用的，因为镜检报告的质量高度依赖于有经验的工作人员检测和区分不同的真菌成分，以及评估是否需要立即采取行动。有经验的人员可根据形态，诊断马尔尼菲篮状菌（一个横隔膜将孢子分开）；另一个例子是鉴别新型隐球菌和皮炎芽生菌，新型隐球菌细胞之间有窄的连接，而皮炎芽生菌为宽基部的出芽。

小结：镜检是一项重要的检查，疑似真菌感染患者的标本应谨慎处理。优化真菌直接镜检应：1.尽可能从感染部位采集标本。2. 从感染或正常无菌部位采集的标本应进行真菌镜检(与培养和非培养方法同步进行)。3.任何阳性真菌成分应根据真菌形态进行描述。报告应包括存在酵母菌、酵母样细胞或菌丝(有或没有分隔)。4. 从感染或正常无菌部位获得标本中真菌的存在可证实真菌感染，独立于培养。5. 特定真菌检出应立即报告临床。

佳图补充

图片来自郭鹏豪老师

图片分别引自（上二）Clinically Relevant Mycoses[书籍]（下左）来自胡龙华老师；（下右）引自医学真菌检验与图解[书籍]

右侧图片引自医学真菌检验与图解[书籍]

图片引自[书籍] Principles and Practice of Infectious Diseases/医学真菌检验与图解

图片来自郭建老师

审者按：该文章与王辉教授牵头撰写的《侵袭性真菌病真菌学检查指南》中关于直接镜检的部分内容，中心思想和写作内容很一致，可以作为指南的一个国外解读版。

指南中关于直接镜检的内容分享

临床考虑侵袭性深部真菌感染采集的样本，均应进行直接涂片镜检（强，高）。直接涂片可评估样本质量，快速明确样本中是否存在真菌，尤其是对尚不能常规培养或常规生长极其缓慢的真菌，以及危重感染患者尤为重要。对于在组织样本中具有特征性形态（注意分隔、分支等）的真菌，直接涂片即可明确诊断。受制于样本中含菌量的多少和直接镜检敏感性等因素，检出真菌孢子或菌丝可明确表示样本中有真菌存在，但阴性并不能排除真菌感染。

所有样本均推荐进行真菌免疫荧光染色，为提高真菌检出的阳性率和准确性，建议采用多种染色方法联合检查（强，高）。真菌免疫荧光染色几乎对所有的真菌均具有敏感度高、特异性强的特点；耶氏肺孢子菌感染的诊断宜用荧光染色与六胺银染色联合检测；隐球菌感染的诊断宜用荧光染色联合墨汁染色和革兰染色；毛霉目感染的诊断宜用荧光染色联合糖原染色。

直接镜检应仔细查找真菌孢子、菌丝和特殊结构（强，中）。孢子可以从其形态、出芽与否及出芽方式，有无假菌丝、厚壁孢子、内生孢子、荚膜 等特点来鉴别，菌丝可以从菌丝的大小、有无分隔、菌丝颜色等分辨。真菌特殊结构如颗粒 、菌核、硬壳小体对于真菌诊断具有重要价值。推荐涂片镜检结果报告，应报告是否检出真菌，并详细描述镜检发现的真菌孢子形状、排列方式，以及菌丝的形态，仅报告真菌检出阳性或阴性是不够的（强，高）。酵母样、腊肠样孢子，内含孢子、厚荚膜圆形孢子等具有特征性的孢子；假菌丝，透明有隔菌丝，无隔飘带样毛霉目样菌丝，暗色菌丝等特征性菌丝——这些初步快速检测结果对于临床诊断方向具有重要参考价值。

文献出处：Knoll MA, Steixner S, Lass-Flörl C. How to use direct microscopy for diagnosing fungal infections. Clin Microbiol Infect. 2023 May 13:S1198-743X(23)00236-7. doi: 10.1016/j.cmi.2023.05.012. Epub ahead of print. PMID: 37187349.

致谢：郭鹏豪（广东省中山大学附属第一医院）、胡龙华（南昌大学第二附属医院）、郭建（上海市东方医院）。

作者简介

徐春晖

病原微生物 副主任技师；中国医学科学院血液病医院 协和博精实验室 ；中国医疗保健国际交流促进会临床微生物学分会委员；中国中西医结合学会检验医学专委会感染病实验诊断专家委员会委员；全国卫生产业企业管理协会实验医学（感染疾病）专家委员会委员；2023年获得“SIFIC优秀中青年临床微生物学者”称号；京港感染论坛公众号"真菌形色"版块版主；参编《血流感染实验诊断与临床诊治》、《医学真菌检验与图解（第二版）》；参译《临床微生物学手册》第11版。

李姝

河南省沁阳市人民医院，副主任检验技师，医学学士；河南省微生物学会细菌耐药检测委员会委员；河南省微生物学会常委。

作者：徐春晖（中国医学科学院血液病医院）、李姝（河南省沁阳市人民医院）；审校：徐和平（厦门大学附属第一医院）

本文转载自订阅号「京港感染论坛」

原链接戳：【真菌形色】如何使用直接镜检法诊断真菌感染

* 文章仅供医疗卫生相关从业者阅读参考

本文完

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