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前言
2022年4月，北京大学人民医院王辉教授团队开展了碳青霉烯耐药大肠埃希菌头孢地尔耐药性监测的多中心研究，相关研究成果发表于《Microbiology Spectrum》（IF=9.043），题目为：Occurrence of High Levels of Cefiderocol Resistance in Carbapenem-Resistant Escherichia coli before Its Approval in China: a Report from China CRE-Network。北京大学人民医院检验科王启、靳龙阳、孙世俊为共同第一作者，王辉教授为通讯作者。
研究背景
由于抗菌药物在临床治疗中的广泛使用，抗菌药物耐药性的发生和碳青霉烯类耐药肠杆菌（CRE）的数量迅速增加。在中国，只有替加环素、黏菌素和头孢他啶-阿维巴坦等少数抗菌药物用于治疗CRE感染，并且都各有一些局限性。CRE感染对中国的医疗保健构成了重大挑战，迫切需要开发和应用新型抗菌药物。
头孢地尔是一种新型儿茶酚胺铁载体头孢菌素，分别于2019年和2020年获得美国食品和药物管理局（FDA）和欧洲药物管理局的批准，但在中国尚未获得批准。本研究旨在对从我国多个中心收集的CRE分离株进行头孢地尔和其他抗菌药物的药敏试验，评估CRE分离株对头孢地尔和其他药物的体外敏感性，揭示我国头孢地尔耐药菌株的主要耐药机制。
结果：CRE的菌种分布和产碳青霉烯酶类型
在2018年至2019年收集的CRE分离株中，肺炎克雷伯菌（798/1158，68.9%）占比最高，其次是大肠埃希菌（181/1158，15.6%）。在肺炎克雷伯菌分离株中，肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（KPC）是主要的碳青霉烯酶，占67.4%（538/798），其次是新德里金属β-内酰胺酶（NDM），占15.3%（122/798）。在碳青霉烯耐药大肠埃希菌中，70.7%（128/181）的菌株产NDM，5.0%（9/181）产KPC，3.3%（6/181）产IMP。（图1）
药敏实验结果
在对1158株CRE菌株进行的21种抗菌药物敏感性检测中，氨曲南-阿维巴坦的敏感率最高（98.3%），其次是头孢地尔（97.3%）、黏菌素（95.3%）、替加环素（91.7%）、头孢他啶-阿维巴坦（66.7%）和阿米卡星（58.9%），碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌对头孢地尔的敏感性最高（99.7%）。（表1）
头孢地尔耐药大肠埃希菌特征
在1158株CRE分离株中，30株对头孢地尔耐药，包括26株大肠埃希菌、2株肺炎克雷伯菌和2株阴沟肠杆菌。
本研究对26株大肠埃希菌进行深入分析，鉴定出6种不同的多位点序列类型(MLST)，其中ST167占76.9%（20/26），其次是ST746，占7.7%（2/26），其余分别为ST405、ST410、ST617和ST11738。值得注意的是，所有26株头孢地尔耐药大肠埃希菌均产NDM-5，1株ST167菌株同时产KPC-2和NDM-5。药敏结果显示，头孢地尔高水平耐药菌株（MIC 32 μg/mL）占92.3%（24/26）。这26个菌株的替加环素MIC均低于1 μg/mL。除一株携带mcr-1基因的菌株MIC为2 μg/mL外，所有菌株的黏菌素MIC为0.5 μg/mL。（表二）
在所有头孢地尔耐药菌株中观察到，在PBP3的333位氨基酸处插入四个氨基酸（YRIN或YRIK）。22个分离株的儿茶酚胺铁载体受体基因cirA在109位氨基酸处截短。（表三）
基于核心基因组的系统发育树显示，26株菌株的遗传距离与MLST的分析结果非常相似。ST167分离株和非ST167分离株之间的耐药基因存在差异，尤其是超广谱β-内酰胺酶相关基因（blaCTX-M）、四环素耐药基因（tetA，tetB）和磷霉素耐药基因（fosA）。在头孢地尔耐药组和敏感组之间，blaNDM的拷贝数没有统计学上的显著差异。（图2）
克隆转化和cirA、blaNDM基因敲除
作者构建了一个基因表达载体，pEASY-T1-PBP3（YRIN/YRIK），表达头孢地尔耐药菌株中PBP3（YRIN/YRIK）的突变基因。通过化学转化将载体导入大肠埃希菌DH5α。药敏结果显示携带PBP3突变体的DH5α的头孢地尔MIC比原始MIC（0.064 μg/mL）增加了4倍（0.25 μg/mL）。
作者同时选择了两株头孢地尔耐药的大肠埃希菌菌株C5492和C6346，其中头孢地尔MIC分别为16 μg/mL和64 μg/mL，这两个分离株中的cirA基因提前出现终止密码子。将携带野生型cirA基因回补到C5492和C6346中后，头孢地尔对C5492和C6346的MIC分别从16降至2 μg/mL和64降至4 μg/mL，分别下降了8倍和16倍。使用CRISPR-Cas9编辑系统在头孢地尔敏感（MIC=1 μg/mL）菌株（C7310）中敲除了cirA和blaNDM基因，结果发现，与C7310亲体株相比，头孢地尔对C7310ΔcirA MIC增加了64倍，从1 μg/mL增加到64 μg/mL。当cirA和blaNDM基因均被敲除时，C7310ΔcirA ΔblaNDM的MIC从64 μg/mL下降到0.5 μg/mL。ATCC 25922敲除cirA基因后，头孢地尔的MIC没有增加。（表四）
小结
该研究发现头孢地尔对中国对大多数CRE菌株具有活性。通过全基因组测序、基因敲除分析等方法，证实ST167大肠埃希菌对头孢地尔的耐药性受到cirA基因提前终止、pbp3突变和携带blaNDM-5等多种机制共同作用。本研究作为中国首次大规模体外开展的CRE分离株对头孢地尔和其他药物耐药性的研究，为CRE治疗和头孢地尔在国内的应用提供了参考。
原文链接
https://journals.asm.org/doi/10.1128/spectrum.02670-21?url_ver=Z39.882003&rfr_id=ori:rid:crossref.org&rfr_dat=cr_pub%20%200pubmed
第一作者简介
王启
北京大学人民医院检验科，副主任技师；全国细菌耐药监测学术委员会青年委员；北京医学会微生物学与免疫学分会青年委员。研究方向：碳青霉烯耐药的肠杆菌科细菌流行病学与耐药机制。主持国家自然科学基金2项，北京市自然科学基金1项，北京大学人民医院院内发展基金2项。以第一作者/共同第一作者发表论文17篇，其中SCI论文10篇。
靳龙阳
研究方向：肺炎克雷伯菌与宿主相互作用研究。临床检验诊断学博士研究生，以第一作者/共同第一作者发表SCI论文6篇。获得国家奖学金2次、创新人才奖学金1次、优博创新基金1次、北京市优秀毕业生、北京大学优秀博士学位论文等奖励奖学金，导师王辉教授。
孙世俊
北京大学人民医院检验科2018级博士研究生，导师：王辉教授。主要研究方向：肺炎克雷伯菌耐药机制探究。参与多项国家级、省部级基金项目。以第一作者或并列第一作者发表SCI论文3篇。
作者：张鹏（北京大学医学部医学检验学系）；审校：王启（北京大学人民医院）
本文转载自订阅号「京港感染论坛」
原链接戳：【CRE专栏】碳青霉烯耐药大肠埃希菌头孢地尔高水平耐药菌株的形成